论文部分内容阅读
抑郁障碍是一种常见的精神疾病,以显著的心境低落和兴趣缺失为主要特征,常伴随其它非特异性症状,如失眠、疼痛、疲劳,严重时可出现自伤甚至自杀行为。在中国,最新的精神疾病流行病学调查显示,精神疾病的发病率越来越高,心境障碍的终身患病率位居第二,高达7.4%,其中超过90%都是抑郁障碍患者。尽管大多数患者可在首次发作的一年内获得缓解,但复发的概率非常高,并且还有相当一部分患者会进展到慢性阶段,抑郁症状可能会伴随其一生,因而严重影响患者的心理社会功能和生活质量。随着新型抗抑郁药的问世,临床治疗效果得到显著提升,药物副作用降低。然而,目前的抗抑郁药物依然存在许多局限性,如起效慢、效果因人而异等,临床诊断很大程度上依赖于患者的主诉和医生的经验,缺乏客观有效的指标,因而抑郁障碍的诊治仍然面临巨大挑战。因此,阐明抑郁障碍的机制,寻找诊断金标准并提供快速有效的针对性治疗,具有重要的临床价值和社会意义。迄今为止,关于抑郁障碍的发病机制有许多假说,如单胺假说、炎症假说、HPA轴改变假说、神经营养假说等,但这些假说仍不能阐明抑郁障碍发生发展的具体分子机制。近年来,缝隙连接蛋白（Cxs）功能紊乱导致抑郁障碍的假说备受关注,这很可能是上述众多假说的分子基础,在抑郁障碍的发生发展中发挥了至关重要的作用。Cxs是细胞间通讯的关键结构,在中枢神经系统（CNS）中大量表达,几乎存在于各种类型细胞中,如神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞等,但在不同细胞中的表型不一样。Cxs还可以形成两种功能形式,即缝隙连接（GJ）和半通道（HC）。正常情况下,Cxs可参与正常的胚胎发育和神经功能过程,但当Cxs表达或功能异常时,许多神经系统疾病便随之产生,如癫痫、阿尔兹海默症、帕金森综合症,以及神经系统炎症和肿瘤等。已有研究发现,在高强度应激模型中,敲低小鼠海马的缝隙连接蛋白可以在悬尾实验（TST）和新奇抑制摄食实验（NSFT）中表现出明显的抗抑郁和抗焦虑作用,在小鼠海马区注射缝隙连接蛋白的非选择性抑制剂——CBX也表现出了相似的效果,因此,这些结果提示Cxs可能在抑郁障碍中发挥了关键作用。我们课题组在前期研究中发现,海马神经元和小胶质细胞释放的高迁移率族蛋白B1（HMGB1）可在慢性应激中介导抑郁样行为,已有研究证实HMGB1可以经由Cxs形成的通道释放,而海马神经元和小胶质细胞中共同表达了Cx36蛋白,因此,本研究主要围绕Cx36在HMGB1介导的抑郁障碍中的作用与机制进行探讨。研究中,我们首先建立慢性不可预见性温和应激（CUMS）模型,四周后通过糖水偏爱实验（SPT）、悬尾实验（TST）、强迫游泳实验（FST）及旷场实验（OFT）检测行为学指标,来判断造模是否成功。行为学实验中,分别给予不同组小鼠HMGB1抑制剂甘草酸（GZA,30mg/kg）,Cx36特异性抑制剂甲氟喹（MQ,15mg/kg）和奎宁（Q,50mg/kg）来观察它们对小鼠抑郁样行为的影响并探讨下游机制;用蛋白免疫印迹方法（Western-Blot）检测小鼠海马和前额叶皮质（PFC）中Cx36蛋白表达的含量。然后在海马组织冰冻切片中用免疫荧光染色（Immunol Fluorescence）的方法将Cx36蛋白分别与神经元、星形胶质细胞及小胶质细胞进行双标,来明确Cx36在海马中的细胞定位及表达情况。为了进一步验证CUMS抑郁模型中炎性因子在不同条件下的释放及变化情况,我们用酶联免疫吸附法（ELISA）测定小鼠海马组织和外周血清中炎性细胞因子HMGB1、TNF-α及IL-1β的释放情况。为了进一步观察应激对小鼠海马神经元兴奋性的影响,我们使用单细胞膜片钳技术（Whole-cell Patch Clamp）记录小鼠海马神经元的动作电位和内向电流。实验中,分别给予细胞LPS（10ug/ml）模拟体内应激环境,甲氟喹（50μM）,奎宁（200μM）和GZA（50μM）用于观察它们对应激诱导神经元兴奋性改变的影响。实验结果显示:四周的CUMS抑郁模型建立成功,CUMS组小鼠出现明显的抑郁样行为,具体表现为糖水偏爱百分比下降,悬尾不动时间延长,强迫游泳漂浮时间延长,给小鼠注射GZA、甲氟喹或奎宁均可以显著改善小鼠抑郁样行为。此后,WB结果显示,CUMS组小鼠海马中Cx36蛋白的表达明显增高,给予GZA可使Cx36明显降低;免疫荧光染色则进一步明确Cx36蛋白主要表达在海马的神经元和小胶质细胞中,在星形胶质细胞中几乎无表达;在慢性应激时,表达Cx36的神经元明显增加,而GZA可以使其降低,上述结果提示GZA可能通过抑制HMGB1降低Cx36蛋白的表达;同时ELISA结果也显示,CUMS小鼠海马组织和外周血清中HMGB1、TNF-α和IL-1β的含量均显著增高,给予甲氟喹和奎宁均可降低上述三种炎性细胞因子的浓度,提示Cx36蛋白可能在抑郁模型中调节了炎性细胞因子的释放。电生理实验结果显示,LPS可以使海马神经元的动作电位幅值和频率增高,阈电位和基电流降低,内向电流明显增大,提示神经元的兴奋性增高;而给予GZA、甲氟喹和奎宁后均可降低动作电位的幅值和频率,增大阈电位和基电流,减小内向电流,从而降低神经元的兴奋性。综上所述,海马神经元Cx36蛋白可能在HMGB1介导的慢性应激所致抑郁障碍中发挥了关键作用,这将为抑郁障碍的临床干预提供新的靶点。