论文部分内容阅读
目的:建立C57BL/6小鼠肾脏缺血再灌注急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）后肾脏慢性纤维化模型,观察急性肾损伤后慢性化进程及肾小管周围毛细血管病变,并探讨补体C3对急性肾损伤后肾脏慢性化过程中周细胞转分化的影响。方法:1、将42只野生型（wild type,WT）C57BL/6小鼠随机分成对照组（Ctr组,n=6）、假手术组（Sham组,n=6）、肾脏缺血再灌注组（IRI组,n=30）,采用双侧肾脏同时夹闭肾蒂45 min后恢复血流的方法建立肾脏缺血再灌注急性肾损伤后肾脏慢性纤维化模型,Sham组仅暴露双侧肾蒂不予以缺血处理,WT IRI组于术后7、14、21、28、42 d各处死6只,最后一天处死Ctr组和Sham组,取血并留取肾脏标本,测血肌酐（serum creatinine,Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）,肾组织HE染色和Masson染色观察肾脏病理改变及胶原沉积,电镜检测管周毛细血管形态学改变,Q-PCR、Western Blot和免疫组化、免疫荧光等方法检测补体C3、Ⅰ型胶原（collagenⅠ,colⅠ）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、CD31、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）mRNA及其蛋白的表达。2、将18只C3基因敲除小鼠（C3 KO）随机分为对照组（Ctr组,n=6）、假手术组（Sham组,n=6）、肾脏缺血再灌注组（IRI组,n=6）;将18只WT C57BL/6小鼠随机分为对照组（Ctr组,n=6）、假手术组（Sham组,n=6）、肾缺血再灌注组（IRI组,n=6）,采用双侧肾脏同时缺血45min后恢复再灌注建立肾脏缺血再灌注急性肾损伤后肾脏慢性纤维化模型,Sham组仅暴露双侧肾蒂不予以缺血处理,于术后21d全部处死,取血并留取肾脏标本,测Scr、BUN;肾组织HE染色和Masson染色观察肾脏病理改变及胶原沉积情况;Q-PCR、Western Blot和免疫组化等方法检测colⅠ、α-SMA、神经元-神经胶质抗原2（Neuron-glial antigen,NG2）、补体C3 mRNA及其蛋白的表达;免疫双荧光检测CD31和NG2定位表达情况。结果:1、在缺血再灌注损伤模型中,补体C3随急性肾损伤慢性化进程,表达显著升高（P<0.05）;与WT Ctr组相比,WT IRI D21、D28、D42组Scr、BUN水平均显著升高（P<0.05）;HE染色显示肾组织病理学改变,肾组织纤维化呈时间依赖性加重。WT Ctr组未见肾间质炎性细胞浸润,WT IRI D14组出现炎性细胞浸润,WT IRI D21、D28、D42组明显增多。Masson染色显示肾小管及肾间质胶原沉积水平呈时间依赖性增高（P<0.05）。WT IRI D7、D14组肾小管及肾间质胶原沉积水平与WT Ctr组和WT Sham组之间无明显差异（P>0.05）。WT IRI D21、D28、D42组评分均显著升高（P<0.05）;colⅠ、α-SMA mRNA及蛋白表达呈时间依赖性升高,与WT Ctr组相比,WT IRI D7、D14组表达均升高,但无明显差异（P>0.05）,WT IRI D21、D28、D42组表达水平均显著升高（P﹤0.05）;随着再灌注时间延长,管周毛细血管密度减少;VEGF蛋白表达呈逐渐下降趋势,与WT Ctr组相比,WT IRI D7、D14组表达均下降,但无明显差异（P>0.05）,WT IRI D21、D28、D42组表达水平均显著下降（P﹤0.05）;电镜显示,WT IRI组周细胞与内皮细胞脱离后,内皮细胞周围的基底膜变薄、脱落,损伤的内皮细胞细胞质和线粒体肿胀。2、WT IRI组和C3 KO IRI组Scr、BUN与Ctr组和Sham组相比均显著升高（P<0.05）,但C3 KO IRI组Scr、BUN水平低于WT IRI组;HE染色显示肾组织病理改变及炎症细胞浸润情况。Ctr组和Sham组未见明显病理改变和炎症细胞浸润,WT IRI组肾小管空泡变性,间质炎症细胞浸润,肾小管内偶见蛋白管型,C3 KO IRI组上述病理改变较WT IRI组明显减轻。Masson染色显示肾小管及肾间质胶原沉积情况。WT IRI组和C3 KO IRI组肾小管及肾间质胶原沉积水平与对照组和假手术组相比均显著升高（P<0.05）,而C3 KO IRI组胶原沉积低于WT IRI组（P﹤0.05）;WT IRI组中colⅠ、α-SMA、NG2、补体C3的表达水平均显著高于WT Ctr组和WT Sham组（P<0.05）,C3 KO IRI组的collⅠ、α-SMA、NG2、补体C3的表达水平均低于WT IRI组（P<0.05）,纤维化程度较其减轻,但仍高于C3 KO Ctr组和C3 KO Sham组（P<0.05）;免疫双荧光显示WT IRI组NG2表达明显高于C3 KO IRI组。结论:1、缺血再灌注导致的急性肾损伤后慢性化过程中,肾间质纤维化并伴有肾小管周围毛细血管损伤、周细胞-间充质转分化、补体C3高表达;2、补体C3基因敲除可减轻缺血再灌注导致的急性肾损伤后肾间质纤维化,减轻肾小管周围毛细血管损伤,抑制周细胞-间充质转分化;3、补体C3可能与急性肾损伤后慢性化过程中周细胞-间充质转分化有一定的相关性,抑制补体C3的激活可改善缺血再灌注导致的急性肾损伤后慢性化。