论文部分内容阅读
乙酰化修饰作为真核生物体内一种可逆的蛋白质翻译后修饰（PTM）,在调节转录活性与基因的表达上都是不可或缺的。组蛋白乙酰转移酶（HATs）和组蛋白去乙酰转移酶（HDACs）作为真核生物体内可逆乙酰化的一种重要的“调节器”,在调节真核生物的可逆乙酰化上发挥着至关重要的作用。c AMP反应原件结合蛋白（CREBP）结合蛋白（CBP或CREBPP）是组蛋白乙酰转移酶家族的成员,它可以催化组蛋白的乙酰化。随着质谱技术的发展,CBP被发现不仅能催化组蛋白的乙酰化,真核生物中约三分之二的非组蛋白也可以被CBP乙酰化。家蚕30K家族蛋白（Bm30K）是一类在脂肪体内生成,大小在30k Da左右的载脂蛋白,它们在家蚕五龄时被运输到血淋巴和其他组织中。本课题组在前期的研究中通过nano‐HPLC/MS/MS技术发现家蚕的血淋巴营养贮藏蛋白中存在大量的乙酰化位点,包括Bm Apo Lp-Ⅱ、Bm Apo Lp-Ⅲ、SP1、SP2、Bm30K-3和Bm30K-15。本课题在前期研究的基础上,开展对家蚕CBP（BmCBP）蛋白催化Bm30K-24的乙酰化并调控Bm30K-24蛋白稳定性及其机制的研究,从而可以为进一步研究BmCBP介导的Bm30K-24蛋白的乙酰化对家蚕能量代谢、胚胎发育和免疫应答等功能的影响打下基础。首先在家蚕卵巢上皮细胞（Bm N）中开展Bm30K-24的过表达和乙酰化鉴定研究。根据Bm30K-24序列（NCBI登录号:NM＿001279446.1）找到其开放阅读框（Open reading frame,ORF）,利用PCR技术对Bm30K-24的ORF片段进行扩增。经过酶切、连接将Bm30K-24的ORF扩增产物连接到p IEx-1-EGFP载体上,构建Bm N细胞的瞬时表达载体p IEx-1-EGFP-Bm30K-24,将瞬时表达载体转染Bm N细胞,通过Western Blot对Bm30K-24在Bm N细胞中的表达进行了检测;再通过免疫共沉淀和Western Blot检测Bm30K-24的乙酰化,结果表明Bm30K-24在Bm N细胞中有较高的过表达,同时过表达的蛋白具有较高的乙酰化水平。为了后续更好的研究乙酰化的对Bm30K-24蛋白表达的影响,通过全基因合成,构建了将Bm30K-24第67位赖氨酸突变为精氨酸的p IEx-1-EGFP-Bm30K-24mut载体,将其和野生型质粒一同转染Bm N细胞,鉴定其乙酰化水平,结果发现乙酰化突变型Bm30K-24蛋白的乙酰化水平明显较低。其次开展乙酰化修饰对家蚕Bm30K-24蛋白表达影响的研究。利用多种去乙酰化酶抑制剂和乙酰化酶抑制剂处理转染了p IEx-1-EGFP-Bm30K-24质粒的Bm N细胞,通过Western Blot检测发现,用去乙酰化酶抑制剂Cocktail、LBH589和乙酰化酶抑制剂A485分别处理细胞后,Bm30K-24蛋白的表达分别出现明显的上调和下调,这暗示了Bm30K-24蛋白的乙酰化水平可以影响其蛋白在细胞内的表达。然后,又对Cocktail、LBH589和A485处理后的细胞通过q RT-PCR检测Bm30K-24在m RNA水平上的变化。结果发现,经Cocktail和A485处理后的Bm N细胞,Bm30K-24在m RNA水平上并未出现明显的趋势变化,这表明了乙酰化修饰对Bm30K-24表达的影响发生在翻译后修饰水平。为了进一步研究乙酰化是否可以在翻译后修饰水平影响Bm30K-24蛋白的表达,将乙酰化位点突变的p IEx-1-EGFP-Bm30K-24mut质粒转染进细胞,结果发现当再次加入Cocktail和A485后,Bm30K-24的蛋白表达并没有明显改变,这表明了在家蚕Bm N细胞中,特定位点赖氨酸乙酰化修饰会对Bm30K-24蛋白在细胞内的表达产生影响。然后开展了催化Bm30K-24蛋白乙酰化的乙酰转移酶鉴定。课题前期研究发现,A485是家蚕乙酰转移酶BmCBP的特异性抑制剂,可以抑制BmCBP的乙酰转移酶活性,从而抑制下游蛋白的乙酰化。因此,基于A485对Bm30K-24蛋白表达的影响,推测催化Bm30K-24蛋白乙酰化的乙酰转移酶为BmCBP。通过Co-IP实验证实了BmCBP可以和His-Bm30K-24发生相互作用,与此同时,当A485和MG132联合处理Bm N细胞后,Bm30K-24蛋白的乙酰化也出现了下降,由此确定了BmCBP可以催化Bm30K-24蛋白的乙酰化修饰。最后开展BmCBP催化的乙酰化修饰对家蚕Bm30K-24蛋白稳定性影响及其分子机制的研究。用A485处理Bm N细胞,随后又用蛋白酶体抑制剂MG132和蛋白合成抑制剂CHX分别时间梯度处理细胞,检测BmCBP催化的乙酰化对Bm30K-24蛋白在细胞内的积累和降解的影响。结果表明,当加入BmCBP乙酰化酶抑制剂A485后,MG132介导的Bm30K-24蛋白在胞内的积累会被阻断;不仅如此,加入A485后,CHX介导的Bm30K-24蛋白在胞内的降解会被加剧。为进一步研究BmCBP催化的乙酰化可以影响Bm30K-24蛋白稳定性的作用机制,将p IEx-1-EGFP-Bm30K-24和p IEx-1-EGFP-Ub载体共转染进家蚕Bm N细胞,并且分别用去乙酰化酶抑制剂Cocktail和乙酰化酶抑制剂A485进行处理,通过IP和Western Blot检测得知,经Cocktail处理后的细胞,Bm30K-24蛋白的乙酰化程度出现了较为明显的提高,而泛素化略微降低;而用A485处理后的细胞,Bm30K-24蛋白的乙酰化出现了较为明显的下降,但是泛素化程度却显著提高。这一结果表明了BmCBP催化的Bm30K-24蛋白赖氨酸残基上的乙酰化修饰和其泛素化存在竞争,推测二者在维持蛋白的稳定性上发挥着重要的作用。