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由于猪呼吸道内同时具有人流感和禽流感的唾液酸受体,因此,猪是禽、猪、人流感病毒共同易感宿主,是流感病毒基因重组或重配的“混合器”。猪流感的公共卫生学意义日益突出,在人类发生流感的历史中,几乎每次的重大流感史都与猪流感有关。大量研究表明:病毒介导宿主病理性免疫应答,引起急性免疫损伤是导致严重的急性呼吸综合症、呼吸衰竭以及免疫系统功能障碍的主要原因。在H1N1猪流感病毒攻毒小鼠mi RNA差异表达研究中发现mi R-124-3p显著上调,生物信息学分析发现mi R-124-3p可能在流感病毒肺损伤调控中发挥重要作用。本研究选用猪流感病毒感染小鼠模型,采用腺病毒介导mi R-124-3p过表达和抑制性表达,并结合转录学分析,系统研究mi R-124-3p调控H1N1猪流感病毒感染小鼠肺损伤的机制。本研究不仅对阐明流感病毒介导免疫损伤的发生机制提供重要科学价值,同时,对探索防控流感病毒导致肺损伤的新靶位有重要指导意义。用SPF鸡胚增殖猪流感病毒A/Swine/GD/2/12(H1N1),经RT-q PCR鉴定,并测定其EID50,结果表明:A/Swine/GD/2/12(H1N1)的EID50为10-6.83/0.2m L。采用Admax系统法在293A细胞中构建mi R-124-3p过表达腺病毒(mi R-124-3p-over),抑制性腺病毒(mi R-124-3p-sponge),空载体腺病毒(mi R-124-3p-blank)然后用构建的腺病毒感染小鼠黑色素瘤细胞,RT-q PCR检测各组mi R-124-3p表达量。结果显示293A细胞表现出绿色荧光,说明腺病毒质粒载体在293A细胞中表达;过表达组,抑制组,空载体组在小鼠黑色素瘤细胞中mi R-124-3p表达水平差异显著,过表达组表达量最高,抑制组表达量最低,空载体组表达量处于中间水平,结果表明:成功构建腺病毒表达载体。75只6周龄雌性Balb/c小鼠,随机分为mi R-124-3p过表达组(A组)、mi R-124-3p抑制组(B组)、对照组(C组)、同型组(D组)空白组(E组),每组15只。各组小鼠分别采用尾部静脉注射mi R-124-3p-over、mi R-124-3p-sponge和mi R-124-3p-blank腺病毒载体;48 h后A组、B组和C组分别用A/Swine/GD/2/12(H1N1)进行滴鼻,D组和E组分别用生理盐水滴鼻,每天记录小鼠体重,状态,滴鼻后24 h、3 d、6 d解剖小鼠,取肺脏,制备石蜡切片、并进行q PCR检测。结果为:A组小鼠的体重高于B组,C组;而B组体重低于C组,且该三组都有体重下降期,体重恢复期,而未滴鼻流感病毒的D组与E组小鼠的体重持续增加;肺脏石蜡切片HE染色观察,B组肺损伤比A组与C组更严重,肺泡间隔表现出增厚,肺泡变小甚至塌陷,A组病变最轻,C组病变程度处于A组与B组之间;q PCR检测肺脏mi R-124-3p表达水平,mi R-124-3p在A组表达水平最高,B组表达水平最低,C组表达量处于中间水平。以上结果表明:mi R-124-3p可以减轻A/Swine/GD/2/12(H1N1)感染小鼠引起的肺损伤,并对小鼠体重产生影响,具有抗炎作用。9只6周龄雌性Babl/c小鼠,随机分成3组,mi R-124-3p过表达组(A组)、mi R-124-3p抑制组(B组)、对照组(C组)。A组、B组、C组分别注射相应的mi R-124-3p-over、mi R-124-3p-sponge、mi R-124-3p-blank腺病毒载体。48 h后,A组、B组和C组小鼠均鼻腔滴加A/Swine/GD/2/12(H1N1),24 h解剖小鼠取肺脏,对A组、C组肺脏进行转录组学分析。转录组学测序发现,差异性基因高度富集于MAPK信号通路,该通路与免疫系统相关并在炎症反应中发挥着作用,同时结合相关文献,最终锁定该通路上的p38α,TNFα,IL-6,IL-1β4个基因,针对该4个基因对mi R-124-3p对H1N1猪流感病毒感染小鼠肺损伤的调控机制进行研究。结果为:A组中4个基因的表达量最低,B组表达量最高,C组基因的表达水平处于A组和B组之间且都差异显著。以上结果表明:mi R-124-3p通过对p38α基因的调控,继而对TNFα,IL-6,IL-1β表达水平进行影响,最终对A/Swine/GD/2/12(H1N1)引起的肺损伤发挥着调控作用。综上所述,本项目通过对mi R-124-3p过表达组、mi R-124-3p抑制组、对照组、同型组和空白组各组A/Swine/GD/2/12(H1N1)攻毒小鼠体重变化分析,病理观察,并结合转录组学分析和q PCR检测,发现mi R-124-3p在A/Swine/GD/2/12(H1N1)感染小鼠肺损伤中具有抗炎作用,其机制可能为mi R-124-3p通过作用于MAPK信号通路中的p38α,降低TNFα、IL-6、IL-1β炎症因子的水平,从而减轻A/Swine/GD/2/12(H1N1)引起的小鼠肺损伤。