【目的】间充质干细胞（MSCs）具有自我更新和多向分化的潜能,可分化为成骨细胞,脂肪细胞和软骨细胞,在维持骨代谢的动态平衡中起着至关重要的作用。褪黑激素是松果体分泌的一种激素,除了众所周知的昼夜调节功能外,褪黑素还可通过调节MSCs的谱系定型和分化信号传导途径对骨代谢进行调节,但作用机制尚不明确,我们前期研究结果发现褪黑素能够促进BMP9（Bone morphogenetic protein 9）诱导的MSCs成骨分化标志物的表达,故提出假说:褪黑素促进BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化。本项研究旨在进一步验证该假说。【方法】1.验证褪黑素促进BMP9诱导MSCs各时期成骨分化标志物的升高。按照对照组,褪黑素组,BMP9组,BMP9和褪黑素共培养组,分别处理间充质干细胞C3H10T1/2细胞。通过对早期成骨标志物碱性磷酸酶活性的定量检测和染色定性检测,观察褪黑素和（或）BMP9对间充质干细胞早期成骨影响;通过对晚期成骨标志物骨钙蛋白和骨桥蛋白进行免疫组织化学染色,观察褪黑素和（或）BMP9处理对间充质干细胞晚期成骨影响;进行茜素红S染色,观察不同处理对间充质干细胞基质矿化结节形成的影响。2.根据上述分组,进行胎鼠肢体体外培养和裸鼠体内干细胞植入实验进一步验证,褪黑素和BMP9处理能否协同诱导成骨作用。在超净台中取E18.5天胎鼠肢体,保留皮肤与肌肉,进行相应处理后于荧光显微镜下观察肢体生长情况,然后固定肢体进行H＆E染色,观察胎鼠肢体的软骨内成骨情况;使用褪黑素和（或）BMP9处理C3H10T1/2细胞,于成骨诱导培养基中诱导7天,种植于4w雄性裸鼠皮下,6周后取出异位骨,进行Micro-CT扫描及重建分析、H＆E染色和Masson’s染色,观察异位骨的生成情况。3.探索褪黑素促进BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化可能存在的机制。使用免疫荧光和蛋白印迹评估褪黑素和（或）BMP9处理C3H10T1/2细胞后,BMP9及其下游Smad1/5/8的表达及定位情况;通过蛋白印迹检测褪黑素协同BMP9促进间充质干细胞成骨分化中,AMPK/β-catenin通路所发生的变化。随后使用si-RNA对AMPK或β-catenin进行沉默,进行蛋白印迹实验和碱性磷酸酶活性检测,进一步验证AMPK/β-catenin通路在褪黑素联合BMP9促进间充质干细胞成骨分化中的作用。【结果】1.褪黑素联合BMP9可显著增强间充质干细胞不同时期成骨标志物的表达。Ad BMP9腺病毒可有效感染C3H10T1/2细胞;褪黑素单独处理可呈剂量依赖性的升高间充质干细胞的碱性磷酸酶活性;按照对照组,褪黑素组,BMP9组,BMP9和褪黑素共培养组,处理C3H10T1/2细胞,结果表明褪黑素联合BMP9组可显著增强间充质干细胞的碱性磷酸酶活性,其活性较其它三组显著升高,碱性磷酸酶染色结果与活性检测相同;在成骨标志物骨桥蛋白和骨钙蛋白的免疫组织化学染色实验结果与碱性磷酸酶检测结果相似,褪黑素显著增强了BMP9的骨桥蛋白和骨钙蛋白表达;对细胞进行矿基质茜素红S染色的结果进一步证实了这一点:褪黑素联合BMP9组形成的矿化结节个数最多,最明显;2.褪黑素有效增强BMP9在胎鼠体外肢体培养和裸鼠体内异位骨形成的干细胞移植实验中起到的成骨诱导作用。在胎鼠体外肢体培养实验中,与BMP9组相比,褪黑激素联合BMP9组显示出更高的荧光强度,表明新骨形成更活跃;H＆E染色显示褪黑激素联合BMP9组具有活跃的生长板区,更高的继发细胞密度和更高的小梁成熟度。在异位骨形成的干细胞移植实验中,我们观察到与BMP9组相比,褪黑激素联合BMP9处理导致骨量增加和相对骨密度增加了30%;Masson染色显示褪黑激素增强了BMP9诱导的矿化骨基质。3.褪黑素促进BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化可能存在的机制。免疫荧光和蛋白印迹结果显示褪黑激素增加间充质干细胞中BMP9的表达,增加p-Smad1/5/8的表达,并诱导p-Smad1/5/8从细胞质转移至细胞核;蛋白印迹检测结果显示,与单独褪黑素或BMP9组相比,褪黑素联合BMP9组中AMPKαThr172位点的磷酸化和β-catenin Ser552位点的磷酸化显着增加;接下使用AMPKαsi RNA或β-cateninsi RNA处理C3H10T1/2细胞,si AMPKα预处理成功阻断了褪黑激素和BMP9共同处理诱导的β-catenin磷酸化;另外,si AMPKα或siβ-catenin预处理显著抑制由褪黑激素和BMP9的协同诱导引起的碱性磷酸酶活性的增加。【结论】1.褪黑激素可促进BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化作用。2.褪黑激素联合BMP9可以直接上调BMP9及其下游靶标,促进p-Smad1/5/8从细胞质向细胞核的转移。3.AMPK/β-catenin途径至少部分参与褪黑激素联合BMP9诱导的成骨分化。