研究背景多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome,PCOS）是育龄期女性常见的妇科内分泌及代谢紊乱性疾病,是引起女性不孕的重要因素之一,全球范围内PCOS发病率约为10～15%,国内育龄期女性PCOS发病率约为5.61%。多囊卵巢综合征主要表现为月经稀发、多毛、痤疮等高雄激素临床表现或高雄激素血症、超声下卵巢多囊样表现。PCOS不但影响患者生殖功能,相关的代谢综合征如胰岛素抵抗、糖脂代谢异常、心血管疾病发病率也相应升高。遗传因素和环境因素相互作用导致成年女性发生PCOS,但其确切病因仍不清楚。近来,生物节律在女性生育中的作用越来越受到关注。生物节律参与调节月经周期、排卵、胚胎着床和妊娠维持。节律紊乱可影响女性正常生殖功能,导致月经不规律、血清中卵泡刺激素和黄体生成素水平改变,早产和生育力下降。现代生活习惯下,许多人需要经常乘飞机跨时区旅行,或需要昼夜轮班工作,在这种情况下会出现机体内部昼夜节律系统紊乱,引起一系列健康问题。有研究发现,需要昼夜轮班工作女性常出现月经周期缩短,伴有痛经以及诸多代谢性疾病如胰岛素抵抗、糖耐量降低等,这些因素与PCOS密切相关。目前研究多阐述节律紊乱与PCOS相关的临床表现之间存在相关性,关于生物节律异常在PCOS相关病理生理变化过程中是否存在作用及其具体机制仍不明确。与生物节律密切相关的褪黑素是否参与这一过程,褪黑素受体是否参与PCOS相关病理生理改变有待研究。另一方面,多项研究发现PCOS患者肠道菌群存在明显改变,并与多项临床指标密切相关,提示肠道微生物在PCOS的发生发展中亦可能存在一定作用。本课题旨在研究生物节律紊乱与PCOS发生发展的关联性,并从分子机制角度探讨褪黑素及其受体在PCOS高雄激素血症形成过程中可能发挥的作用、解析肠道菌群与PCOS相关病理变化之间的联系。研究方法1.节律紊乱多囊卵巢综合征模型的构建:我们采用90只6周龄的SD（Sprague Dawley）大鼠建立节律紊乱动物模型。所有大鼠在上海交通大学医学院附属仁济医院动物房SPF环境中适应性饲养一周后开始正式实验。所有大鼠随机平均分配至对照组、光照组、黑暗组,每组30只大鼠。对照组大鼠在12小时光照/12小时黑暗、光照组大鼠在24小时持续光照、黑暗组大鼠在24小时持续黑暗环境中饲养10周。实验过程中,持续测量每组大鼠体重增长情况、动情周期、糖耐量等指标。根据给予光照时刻（zeitgeber time,ZT;8:00给予光照记为ZT0）每隔4h分别收集ZT0、ZT4、ZT8、ZT12、ZT16、ZT20共6个时间点的大鼠血清及卵巢组织,分别检测性激素、进行切片HE染色以确定节律紊乱与PCOS的发生之间是否存在关联。2.持续黑暗引起大鼠高雄激素血症机制研究:采用第一部分中各组模型大鼠卵巢组织,研磨后通过q RT-PCR检测褪黑素受体在m RNA水平的表达差异,并检测大鼠血清中褪黑素浓度以了解节律紊乱对褪黑素及其受体表达的影响。另一方面,检测卵巢局部激素合成酶CYP17A1及CYP19A1的表达情况,明确高雄激素血症的形成原因。利用KGN细胞系为细胞模型,进行敲低、过表达基因MTNR1A等实验,通过q RT-PCR和Western Blot等方法研究MTNR1A对芳香化酶的影响及具体作用机制。3.肠道菌群与持续光照引起的大鼠多囊卵巢综合征样变化相关性研究采用6周龄的雌性SD（Sprague Dawley）大鼠共22只,所有大鼠在上海交通大学医学院附属仁济医院动物房SPF环境下适应性饲养一周后平均分配至对照组（L/D group）、光照组（L/L group）,每组11只。对照组大鼠在12小时光照/12小时黑暗环境、光照组大鼠在24小时持续光照环境中饲养4周。持续检测每组大鼠体重增长情况、动情周期、糖耐量等指标。四周后检测各组大鼠血清睾酮、卵泡刺激素、黄体生成素、抗苗勒管激素等内分泌激素指标及卵巢局部形态学变化。从对照组、光照组大鼠中均随机挑选5只大鼠,从实验开始前至实验结束时于每周同一时间收集它们的肠道粪便标本用于16S r RNA测序分析。研究结果1.节律紊乱模型大鼠的构建与多囊卵巢综合征相关性:经过十周干预后,光照组及黑暗组大鼠卵巢质量和体重与对照组相比均未有差异。光照组大鼠动情周期明显紊乱,而黑暗组大鼠出现动情周期延长。与对照组相比,两组大鼠在卵巢形态方面均出现明显变化,包括卵巢多囊样改变、卵泡壁变薄、卵泡异常扩张。在内分泌激素方面,光照组、黑暗组大鼠均出现血清LH浓度升高,LH/FSH比值上升。与对照组相比,黑暗组大鼠血清总睾酮浓度上升,空腹血糖水平升高。两组大鼠均出现类PCOS样改变。2.持续黑暗引起大鼠高雄激素血症机制研究:（1）黑暗组大鼠血清中褪黑素浓度无明显改变;在m RNA水平上,ZT16点时卵巢整体褪黑素受体Mtnr1a表达量低于对照组;免疫组化实验显示卵巢颗粒细胞中MTNR1A含量低于对照组。（2）在m RNA水平上,黑暗组大鼠卵巢局部Cyp19a1表达量降低,Cyp17a1表达量无明显改变,Ar表达量于ZT16点明显下降。（3）在KGN细胞系中敲低MTNR1A后,CYP19A1及AR的蛋白表达量降低;敲低MTNR1A后在生理浓度10 nmol/L睾酮处理24小时后,CYP19A1及AR的蛋白表达量均降低;敲低MTNR1A后细胞培养上清液中雌二醇含量明显降低。（4）KGN细胞中敲低AR后,CYP19A1表达量在mRNA水平上降低;敲低AR后在生理浓度10 nmol/L睾酮中处理24小时后CYP19A1的蛋白表达量明显降低。过表达AR后,CYP19A1的蛋白表达量上升;敲低MTNR1A的同时过表达AR,CYP19A1的蛋白表达量高于仅过表达AR组。3.肠道菌群与持续光照引起的大鼠多囊卵巢综合征样变化相关性研究（1）经历四周光照处理后,大鼠出现动情周期改变、卵巢多囊样变化、血清AMH升高、SHBG、LH含量异常等变化。（2）光照组大鼠脂肪、肝脏组织内糖脂代谢相关基因表达量在m RNA水平上发生变化。（3）处理四周后,两组大鼠肠道菌群α多样性无明显改变,肠道菌群β多样性出现明显差异。在属水平上,光照组大鼠肠道中类萨特氏菌（Parasutterella）富集,肠道菌Corynebacterium、拟杆菌目Odoribacter及不动杆菌（Acinetobacter）含量下降。相对丰度改变的肠道微生物与类固醇激素合成、Gn RH信号通路、糖原的合成与代谢等PCOS相关通路可能相关。（4）随时间推移,对照组、光照组大鼠肠道菌群多样性与组成结构都出现了明显改变。随着光照时间延长,大鼠肠道中厚壁菌门相对丰度逐渐升高、拟杆菌门含量逐渐降低,变化趋势与代谢性疾病中的变化情况相似。结论研究发现节律紊乱可引起大鼠动情周期紊乱、卵巢多囊样改变、内分泌激素水平改变等类PCOS样表现,证实生物节律与PCOS之间存在相关性,在多囊卵巢综合征的发生发展过程中存在一定作用。持续黑暗还可引起大鼠雄激素水平升高和空腹糖耐量受损。褪黑素受体MTNR1A在持续黑暗引起的高雄激素血症中发挥一定作用。MTNR1A低表达可导致芳香化酶CYP19A1含量降低,从而降低颗粒细胞将雄激素转化为雌激素的能力,血液中雄激素积累进而引起高雄激素血症。这一过程由雄激素受体参与,MTNR1A低表达后AR表达量下降,过表达AR可阻断MTNR1A对CYP19A1的调节作用。另一方面,持续光照会引起大鼠肠道微生物组成结构改变,多种肠道菌属丰度发生明显变化,并与PCOS中多项代谢通路可能相关。研究发现,褪黑素受体、肠道菌群在雄激素转化、类固醇生成、糖代谢异常等PCOS病理生理过程中可能存在一定作用,为PCOS的发生机制提供新的研究思路,在生物节律紊乱的PCOS患者人群的临床防治提供新思路和新靶点。