【摘 要】
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N-myc下游调节基因1（NDRG1）是NDRG家族中最早发现的一种抑癌基因,能够在调节细胞分化、增殖、凋亡、血管生成、肿瘤发生和转移以及重金属和缺氧诱导的应激反应的过程中发挥作用。胚胎植入是哺乳动物妊娠过程中极为关键的一步,而滋养层细胞的迁移与侵袭特性保证了胚胎植入的顺利完成,同时滋养层细胞能产生大量对胚胎发育及妊娠维持所必需的多种激素和因子,所以滋养层细胞在妊娠过程中扮演着极其重要的作用。多项
【基金项目】
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国家自然科学基金项目PPARγ介导脂质代谢途径调控绵羊胚胎附植的作用及机制（项目编号:32060751）； 省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室开放课题永生化绵羊滋养层细胞系的建立及单增李斯特杆菌致绵羊滋养层细胞凋亡的信号通路研究（项目编号:MYSKLKF201905）；
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N-myc下游调节基因1（NDRG1）是NDRG家族中最早发现的一种抑癌基因,能够在调节细胞分化、增殖、凋亡、血管生成、肿瘤发生和转移以及重金属和缺氧诱导的应激反应的过程中发挥作用。胚胎植入是哺乳动物妊娠过程中极为关键的一步,而滋养层细胞的迁移与侵袭特性保证了胚胎植入的顺利完成,同时滋养层细胞能产生大量对胚胎发育及妊娠维持所必需的多种激素和因子,所以滋养层细胞在妊娠过程中扮演着极其重要的作用。多项研究表明NDRG1与人或小鼠的妊娠有着紧密的联系,而滋养细胞的侵袭行为类似于肿瘤细胞。本研究探索NDRG1在绵羊滋养层细胞中的差异表达是否可以改变滋养层细胞的迁移和侵袭,从而影响绵羊的妊娠过程,为研究绵羊妊娠过程提供科学依据。目的:（1）探究NDRG1基因在滋养层细胞的定位,并揭示NDRG1与滋养层细胞的位置关系,发现NDRG1基因与迁移相关基因在死胎和妊娠绵羊滋养层组织中的表达是否存在差异;（2）构建NDRG1慢病毒表达载体和干扰载体,建立绵羊滋养层组织NDRG1差异表达细胞模型;（3）探究NDRG1基因的差异表达对绵羊滋养层细胞迁移侵袭能力影响方法:（1）采集分离绵羊子宫,以胎儿妊娠时间表判断胎儿是否正常妊娠,通过HE和IHC的方法对死胎和妊娠绵羊滋养层组织和NDRG1进行定位,通过q RT-PCR的方法检测NDRG1和与迁移相关基因（E-cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9）在不同组织中的表达;（2）构建NDRG1过表达和干扰慢病毒载体,瞬时转染至239T细胞中,通过q RT-PCR和Western blot的方法对目的基因进行检测,验证其功能;利用三质粒系统包装慢病毒,确定病毒滴度,检验其侵染效率,通过侵染的方法导入原代绵羊滋养层细胞,构建绵羊滋养层细胞NDRG1过表达和干扰细胞模型;（3）利用上述细胞模型,通过q RT-PCR探究NDRG1基因的过表达和干扰对细胞周期、迁移和侵袭能力相关基因的影响,同时利用CCK-8和划痕实验检测NDRG1基因的过表达和干扰对绵羊滋养层细胞增殖和迁移的影响。结果:（1）证明NDRG1的表达在死胎和正常妊娠的滋养层组织中存在差异,而死胎组织中其转录水平极显著增高（P＜0.01）;死胎组织中迁移和侵袭相关基因Vimentin和MMP2转录水平极显著降低（P＜0.01）,提示死胎滋养层组织中NDRG1的异常表达影响滋养层细胞迁移和侵袭能力,NDRG1表达增高可能是导致妊娠失败的原因;（2）构建了NDRG1慢病毒过表达载体（CD513B-1-NDRG1）,经酶切鉴定和测序显示该载体构建成功,将过表达载体和酶切鉴定后的慢病毒干扰载体共同瞬时转染进入293T细胞,筛选出一条最佳干扰载体（NDRG1-sh RNA3）用于后续实验;慢病毒载体导入293T细胞中包装,经包装测得CD513B-1-NDRG1病毒浓度滴度为2E+8TU/m L,NDRG1-sh RNA3病毒浓度滴度为6E+7TU/m L;病毒浓缩液成功侵染绵羊滋养层细胞,构建绵羊滋养层细胞NDRG1基因过表达和干扰细胞模型;（3）NDRG1过表达极显著增强了E-cadherin和β-catenin的转录水平（P＜0.01）,显著抑制了Vimentin和MMP2（P＜0.05）、MMP9和Slug（P＜0.01）的转录水平;显著抑制了CCND1的表达水平（P＜0.05）,阻碍了细胞的正常周期;CCK8和划痕实验显示,抑制了体外细胞的增殖与迁移。NDRG1干扰显著增强了Vimentin和MMP9（P＜0.01）、MMP2和Slug（P＜0.05）的转录水平,显著抑制了E-cadherin（P＜0.01）和β-catenin（P＜0.05）的转录水平;CCK8和划痕实验显示,促进体外细胞的增殖与迁移,结果表明NDRG1的增高会导致妊娠失败;结论:本研究发现在死胎滋养层组织中NDRG1的表达增高,与迁移侵袭相关基因表达降低,推测NDRG1的表达升高与妊娠失败相关。体外细胞实验证明,NDRG1对细胞周期、细胞增殖、细胞迁移侵和袭能力具有一定的调控作用。表明在体外,绵羊滋养层细胞中NDRG1表达升高阻碍了妊娠的发生,为研究早期妊娠失败的分子机制提供线索,了解绵羊NDRG1基因功能开拓了视野。
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