【摘 要】
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胚胎附植是动物囊胚滋养层细胞与母体子宫内膜上皮细胞逐步建立组织和生理上的联系的过程,在此过程中,滋养层细胞由附植完成前的胚胎滋养层细胞,发育成附植后的胎盘滋养层细胞。Notch通路可在发育过程中调控细胞命运,是组织和胚胎发育的重要通路之一。Notch信号通过相邻细胞之间的配体-受体相互作用激活,促进Notch受体的γ-分泌酶依赖性切割,并将Notch胞内结构域（NICD）释放到细胞核中,与转录因子
【基金项目】
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国家自然科学基金项目,PPARγ介导脂质代谢途径调控绵羊胚胎附植的作用及机制（项目编号:32060751）； 省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室开放课题,永生化绵羊滋养层细胞系的建立及单增李斯特杆菌致绵羊滋养层细胞凋亡的信号通路研究（项目编号:MYSKLKF201905）；
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胚胎附植是动物囊胚滋养层细胞与母体子宫内膜上皮细胞逐步建立组织和生理上的联系的过程,在此过程中,滋养层细胞由附植完成前的胚胎滋养层细胞,发育成附植后的胎盘滋养层细胞。Notch通路可在发育过程中调控细胞命运,是组织和胚胎发育的重要通路之一。Notch信号通过相邻细胞之间的配体-受体相互作用激活,促进Notch受体的γ-分泌酶依赖性切割,并将Notch胞内结构域（NICD）释放到细胞核中,与转录因子CSL结合,激活该通路,从而调节细胞的分化、侵袭等过程。Notch通路可通过调节绵羊滋养层细胞的生物学作用从而调节绵羊胚胎附植的过程。目的:研究Notch通路激活剂JAG-1和抑制剂DAPT对绵羊滋养层细胞增殖、凋亡与周期、迁移侵袭的影响;方法:（1）采用组织块培养法、胰酶消化法和胰酶+组织块法分离原代滋养层细胞,通过胰酶差时消化法对细胞进行纯化,观察滋养层细胞的形态学特点和生长特性,利用免疫细胞化学法对滋养层细胞的特异性表达角蛋白7（cytokeratin7,CK7）进行鉴定,通过RT-PCR对绵羊滋养层细胞标志基因干扰素-τ进行检测,同时使用孕酮（P4）、雌二醇（E2）和干扰素-τ（IFN-τ）处理滋养层细胞,实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测胚胎附植相关基因的转录水平;（2）体外培养绵羊滋养层细胞,将滋养层细胞分为Notch通路激活组、Notch通路抑制、空白对照组,采用CCK8法检测JAG-1和DAPT对细胞增殖活力的影响;采用q RT-PCR检测各组细胞中Notch1和配体Jagged-1、靶基因Hes1、VEGF和细胞周期相关基因CCNA2、CCNB1、Cyclin D1的转录水平,WB法检测Notch1及凋亡相关蛋白Caspase-9、Bcl-2、Bax、Cyt c的蛋白表达水平;（3）细胞划痕试验检测各组细胞的迁移,q RT-PCR检测各组细胞中侵袭相关基因MMP-2、MMP-9的转录水平,采用ELISA和q RT-PCR分别检测Notch通路对前列腺素E2（PGE2）和前列腺素F2α(PGF2α)分泌和前列腺素合成酶表达的影响。结果:（1）结果显示,与其它方法相比,利用胰酶+组织块法细胞生长周期较短,观察细胞均呈上皮样生长。滋养层细胞鉴定CK7染色阳性结果大于95%。RT-PCR检测到分离的绵羊滋养层细胞可正常表达干扰素-τ（IFN-τ）。此外,通过P4、E2和IFN-τ处理后,胚胎附植相关基因ISG15、CXCL10、RSAD2、CTSL、SPP1和MUC1在滋养层细胞中的表达水平均显著上调。证实该细胞可体现出胚胎附植过程中母体胎盘滋养层的主要特性,为后续试验提供滋养层细胞基础。（2）Notch通路抑制剂DAPT显著抑制滋养层细胞的增殖并具有时间和剂量依赖性,而JAG-1对滋养层细胞的增殖无显著影响。与对照组相比,激活组Jagged-1、Hes1、VEGF表达水平极显著上调（P＜0.01）,而抑制组Notch1、Jagged-1、Hes1、VEGF表达水平显著下降（P＜0.05）;激活组和抑制组CCNA2和CCNB1在转录水平上显著降低,而Cyclin D1,激活组表达水平显著升高,抑制组显著降低。与对照组相比,Notch1蛋白激活组显著降低,抑制组显著升高;细胞凋亡相关蛋白,（3）抑制组抑制凋亡蛋白Bcl-2表达减少（P＜0.05）,促凋亡蛋白Bax、Caspase9、Cyt c表达增加（P＜0.05）,激活组凋亡相关蛋白表达与之相反。表明Notch通路影响绵羊滋养层细胞的增殖和凋亡能力。（4）激活组与对照组相比其细胞迁移率显著升高,抑制组显著降低。q RT-PCR结果显示,与对照组相比,激活组MMP-2、MMP-9表达水平极显著上调（P＜0.01）,而抑制组MMP-9显著升高（P＜0.05）,MMP-2无显著差异（P＞0.05）。ELISA结果显示,与对照组相比,激活组PGE2显著升高,抑制组PGF2α显著降低,抑制组PGE2和激活组PGE2无显著差异（P＞0.05）。与对照组相比,抑制组PTGS1和PGFS的基因表达显著降低（P＞0.05）,PTGS1和PTGES显著升高（P＞0.05）;激活组结果与之相反。表明Notch通路影响绵羊滋养层细胞的迁移侵袭能力。结论:本研究通过胰酶+组织块培养法结合胰酶差时消化法成功分离和纯化绵羊原代滋养层细胞;并通过Notch通路激活剂JAG-1和抑制剂DAPT处理绵羊滋养层细胞,Notch1表达升高对滋养层细胞增殖无显著影响,可减少细胞凋亡,对细胞迁移侵袭能力有促进作用;Notch1表达降低可抑制滋养层细胞增殖,促进细胞凋亡,滋养层细胞的体外迁移侵袭能力降低。表明Notch通路对绵羊滋养层细胞基本功能的调控作用,为进一步研究Notch通路对绵羊胚胎附植的影响奠定了基础。
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