牛病毒性腹泻-黏膜病(BVD)是由牛病毒性腹泻-黏膜病病毒感染牛引起的以发热、咳嗽及怀孕母牛流产或产出畸形胎儿为主要特征的一种传染病。BVDV是瘟病毒属的代表种,该病毒只有一个血清型。BVDV可引起牛、羊、鹿、猪多种动物感染。由于鹿是经济价值较高的动物,鹿感染BVDV可造成母畜流产、死胎、弱胎、畸形胎及产下病毒血症仔鹿,还可导致鹿的采食障碍和营养吸收受阻,以致继发感染,严重影响幼鹿的发育和成鹿的生产性能,甚至造成鹿的大批死亡,这将给养鹿业造成严重的经济损失。目前尚没有有效防制本病的疫苗,因此鹿群一旦爆发该病将产生严重经济损失,因此对鹿BVDV的研究就显得尤为重要。鉴于BVDV的流行情况和难以防制的特点,本实验选择了具有良好免疫原性的E2基因为研究对象,通过对E2基因进行克隆与序列分析,为建立诊断方法和研制有效防制BVDV的疫苗打下基础。本实验采用MDBK细胞从长春某鹿场采集的鹿粪样中分离出一株致细胞病变型BVDV毒株。将分离的毒株接种于MDBK细胞培养增殖,经5-6次连续传代至出现明显的细胞病变,收集细胞培养液,并浓缩病毒。通过对分离株的培养特性、生物学、免疫学特性等进行鉴定,结果表明其基本特性与标准毒株一致;进而进行分子生物学鉴定,通过合成一对BVDV特异性引物对分离毒株进行鉴定,在约300bp处出现目的条带,证明该毒株为BVDV毒株,因此命名为CHL株;同时为鉴定此毒株的基因型,合成一对BVDV基因分型引物,结果在500-750bp处出现目的条带,证明毒株属基因Ⅰ型。合成一对套式引物F1、F2,R1、R2对E2基因进行扩增,电泳测定用F2/R2扩增F1/R2的PCR产物大小为1.4kb,经回收纯化后,连接于pMD18-T vector,获得重组质粒pMD18-E2,转化E’coli Top10,经蓝白斑筛选,挑取阳性克隆,提取质粒,进行酶切鉴定和PCR鉴定,对鉴定为阳性的质粒进行测序。测序结果表明CHL株E2基因长为1122bp。从GenBank中搜寻已发表的Deer-GB1,SH9,S10,NewYork-Ⅰ,NADL,Osloss,Oregon CV24,Changchun184,SD-1,ZM-95,Shinara等毒株的E2基因序列,应用DNAstar软件进行核苷酸、推导氨基酸同源性比较,结果分离株与Changchun184株的核苷酸和氨基酸同源性最高,为99.2%;与日本Shinara株的同源性最低,为71.2%;与其它毒株同源性分别为,Osloss92.8%,CV24 74.6%,SD-1 74.6%,NADL73.5%,SH9 72.7%,ZM72.5%,Deer-GB1 73%,S1072.1%。系统进化树分析表明,分离株与184和Osloss株的遗传关系较近。通过对E2基因的核苷酸序列和推导氨基酸序列分析,结果表明,E2基因编码374个氨基酸,含有16个半胱氨酸残基,4个N-糖基化位点,与184株及Osloss株相同。