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当今,乳腺癌是世界范围内威胁女性健康的一大杀手。其中,三阴性乳腺癌首当其冲。三阴性乳腺癌是乳腺癌的一个亚型,其不表达雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体,缺乏有效的治疗靶点,同时具有较高的侵袭性和复发潜能,成为临床治疗上一个非常棘手的问题。乳腺癌干细胞(Breast cancer stem cells,BCSCs)的出现为三阴性乳腺癌的治疗带来了曙光。乳腺癌干细胞理论认为,乳腺癌干细胞是肿瘤细胞中一小类具有自我更新和多向分化潜能的肿瘤细胞,是肿瘤发生、发展和转移的罪魁祸首。因而针对肿瘤干细胞在乳腺癌中的治疗,特别是在三阴性乳腺癌中的治疗成为了学界的研究热点。人胚胎干细胞转录因子NANOG被报道其在胚胎干细胞和人正常干细胞中的干性维持起着非常重要的作用。但是有趣的是,有人研究发现NANOG在乳腺癌中的表达水平明显升高,并且与预后负相关。众所周知,肿瘤干细胞与人胚胎干细胞存在着千丝万缕的联系,但是目前对调控胚胎干细胞的重要转录因子NANOG及其不同假基因在乳腺癌干细胞中的作用,特别是在三阴性乳腺癌干细胞中的作用却知之甚少。目的:因此,我们为了探讨NANOG及其不同假基因在三阴性乳腺癌干细胞中的作用,旨在为三阴性乳腺癌提供一个潜在的治疗靶点,改善三阴性乳腺癌患者的预后,我们开展了我们的研究:方法:1)首先,我们微球体培养技术建立了乳腺癌干细胞培养的模型。并且通过Western-blot和PCR等技术分析了NANOG基因在三阴性乳腺癌细胞系和乳腺癌干细胞中的表达。2)构建了慢病毒介导的NANOG基因敲减技术,并且对三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468进行转染,并分析NANOG敲减对TNBC细胞系干细胞特性的影响。3)我们进一步通过ChIP和PCR等方法研究了NANOG参与三阴性乳腺癌干细胞的干性维持机制,并使用特异性的抑制剂对NANOG参与TNBC干性调控的具体机制进行验证。4)NANOG是一个比较特殊的转录因子,具有11个假基因。为了为乳腺癌干细胞精准治疗提供更加精确的靶点,我们研究了NANOG的不同假基因在三阴性乳腺癌干细胞中的表达。结果:1)通过进一步的研究我们发现,与其他亚型相比,三阴性乳腺癌的CD44~+/CD24~-表型的干细胞比例明显升高。而微球体细胞中CD44~+/CD24~-表型的干细胞比例与对应的贴壁细胞相比也明显升高。联想到三阴性乳腺癌具有高度侵袭性的表型,我们推测肿瘤干细胞在三阴性乳腺癌的生物学行为方面扮演了非常重要的角色。2)通过进一步的PCR和Western-blot技术,我们研究发现NANOG不仅在微球体来源的干细胞和流式分选的CD44~+/CD24~-的表达明显增加,而且在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468和BT-549细胞系中表达明显增加,这提示了NANOG能够通过调控肿瘤干细胞的比例和干性参与三阴性乳腺癌干细胞的进展、侵袭和转移。3)我们在成功地敲减后TNBC中NANOG的表达之后发现,CD44~+/CD24~-表型的乳腺癌干细胞比例明显下降。此外,在干细胞功能方面,NANOG敲减后的肿瘤细胞自我更新能力、微球体形成能力和增殖能力都明显降低。在体内水平,我们通过构建NOD/SCID小鼠荷瘤模型也验证了NANOG对三阴性乳腺癌干细胞成瘤性的影响。4)通过PCR和Western-blot技术我们发现,NANOG基因敲减后,WNT通路的重要成员CK1α的表达明显降低。有趣的是,ChIP结果提示,NANOG基因能够直接与CK1α的启动子区域结合,调控CK1α的转录。并且无论是在体内水平还是在体外水平,通过使用CK1α的特异性抑制剂PP能够抑制NANOG对三阴性乳腺癌干细胞的调控作用。这些结果提示我们NANOG-CK1α-WNT pathway可能在三阴性乳腺癌干细胞的干性调控中起了非常重要的作用。5)通过PCR产物测序和AlwNI核酸内切酶的剪切分析,我们发现NANOGp8是乳腺癌细胞中的优势转录本,为NANOG靶向治疗提供了更加精准的靶点。结论:我们发现NANOGp8而非NANOG1是三阴性乳腺癌贴壁细胞和三阴性乳腺癌干细胞的优势假基因,在TNBC的干性维持中起了非常重要的作用,有望成为未来治疗的靶点。