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水稻种子的胚乳不仅是贮藏淀粉和蛋白质的重要器官,是人类重要的食物来源,也是一种理想的生物反应器。然而重组蛋白表达水平低下仍然是制约水稻种子成为稳定、高效生物反应器的瓶颈。如何进一步提高外源重组蛋白在水稻种子中的表达量是人们亟待解决的问题之一。5’非翻译区(UTR)是一段位于翻译起始点上游的序列,在转录水平或(和)转录后水平对基因的表达调控具有重要作用。为了研究水稻种子贮藏蛋白基因5’-UTR对外源基因表达的调控作用,进一步优化水稻种子生物反应器生产外源重组蛋白体系,我们对6个水稻种子贮藏蛋白基因5’-UTR在水稻种子中调控外源基因表达的作用进行了研究。
研究中所用的6个水稻种子贮藏蛋白基因5’-UTR分别来自:3个谷蛋白基因GluA-1,GluA-2和GluC;2个醇溶谷蛋白基因10 kDa,16 kDa;1个26 kDa球蛋白基因Glb-1。将这6个5’-UTR构建在不同的启动子下游,以GUS基因为报告基因,利用农杆菌介导进行水稻遗传转化。GUS组织染色和RT-PCR分析显示,GUS蛋白只在水稻胚乳中表达,在根、茎、叶和胚中不表达,表明这6个5-UTR不改变GluC启动子的胚乳表达特异性。对开花后17天水稻种子的GUS活性测定,这6个5’-UTR都可以显著提高GUS蛋白在种子中的表达量,推测水稻贮藏蛋白基因5’-UTR提高外源蛋白表达量是一种普遍现象。另外,增强作用最强的Glb-1-5’-UTR和GluA-1-5’-UTR在启动子Glb-1,CMV35S和OsAct-2的驱动下,无论是在水稻稳定转化还是在瞬时转化体系下,都能够显著提高GUS蛋白的表达量,推测这两个5-UTR增强外源蛋白表达量的特性不依赖于上游启动子序列。Real-time RT-PCR检测结果表明,Glb-1-5’-UTR和GluA-1-5’-UTR并没有明显影响GUS mRNA的累积量,其主要是在转录后水平发挥作用提高外源GUS蛋白的表达。
植物油脂作为最有利于种子传播和萌发生长的能量和碳源物质,贮存和积累于植物种子的贮油细胞器-油体(oil body)中。油体蛋白是油体最主要的相关蛋白质,对油体的稳定、合成和降解都起着重要的生物学作用。对油体蛋白的研究主要集中在合成、定位及在生物工程中的应用,对其在种子油脂的积累和种子发育的影响方面研究较少。我们在水稻种子胚和糊粉层中异位表达大豆24kDa油体蛋白基因GM-A和GM-B,研究其对水稻种子油脂累积及种子发育的影响。研究结果显示,外源大豆油体蛋白基因在水稻种子胚球蛋白(Reg2)基因启动子的驱动下,能够正确的在水稻种子胚和糊粉层中表达。转基因植株中内源16 kDa和18 kDa oleosin基因的表达量不受外源大豆油体蛋白基因表达的影响。异位表达大豆油体蛋白能够使水稻种子胚中的油体变小,油体数目变多,蛋白贮藏液泡显著增大。和野生型对照相比,转基因水稻种子的油脂含量和种子重量显著增加,但油脂中的游离脂肪酸组分变化不大。与此同时,水稻种子中的贮藏物质-蛋白质和淀粉的含量显著下降。这些结果说明油体蛋白不仅影响油体的结构,而且对种子中油脂和贮藏物质的累积具有一定的调控作用。