Ⅰ:沙蚕纤溶酶—沙蚕激酶的克隆、表达及活性测定;Ⅱ:汉滩病毒截短核蛋白的表达和初步应用

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①目的:从沙蚕上皮细胞的cDNA文库中克隆和表达具有纤溶活性的一种新型的丝氨酸蛋白酶。②方法:使用Trizol试剂从沙蚕消化道上皮细胞中提取总RNA,利用3’RACE构建cDNA文库。以特异性的引物筛选获得包含丝氨酸蛋白家族保守位点的阳性克隆,进行核苷酸测序。将测得的序列所编码的相应蛋白使用分子生物学软件进行功能预测和二级、三级结构的模拟,结果显示该蛋白与来源于哺乳动物的丝氨酸蛋白酶相似,具有该家族保守的催化位点。将该基因克隆到原核表达载体pGEX4T-2中,质粒转化宿主菌DH5α,经IPTG诱导表达目的融合蛋白,凝血酶酶切纯化后经SDS-PAGE鉴定,并使用纤维蛋白平板法初步测定纯化蛋白的纤溶活性。③结果:获得具有溶栓活性的沙蚕激酶的编码序列以及表达该蛋白的重组菌,并得到37KD的融合蛋白和9KD的目的蛋白,纤维蛋白平板初步鉴定表明该蛋白有激活纤维蛋白原的激酶活性。④结论:在原核表达系统中成功表达了具有纤溶活性的沙蚕激酶,该蛋白有可能成为一种新型的纤溶药物。
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