论文部分内容阅读
Hepcidin是一个主要在肝脏表达的含8个半胱氨酸残基的小分子多肽,是机体铁稳态调控途径中关键性的效应分子,其主要生物学功能在于调节小肠上皮细胞对于铁的吸收。另外,hepcidin和许多富含半胱氨酸的抗菌肽类似具有显著的抗菌作用。本文采用大肠杆菌表达体系进行了人hepcidin的融合表达,并对重组hepcidin的生产工艺进行了研究。 根据hepcidin氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏好性,化学合成了人hepcidin的基因序列,并在hepcidin编码序列的5′端引入了肠激酶特异性识别位点序列。我们首先构建了hepcidin的GST融合表达载体pGEX-hpc。尽管pGEX-hpc在25℃表达的GST-hepcidin 50%为可溶蛋白,但可溶蛋白不能采用谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析进行纯化。在载体pGEX-hpc的基础上构建了表达载体pET-hpc,pET-hpc表达的融合蛋白His-hepcidin大小为10.6kDa,N端带有6×His标签,并且其N端的担体序列中不含有半胱氨酸,hepcidin在His-hepcidin中所占比例为26.6%。采用His-hepcidin进行hepcidin的制备。 载体pET-hpc在E.coli BL(DE3)中表达的His-hepcidin融合蛋白以包涵体的形式存在。His-hepcidin诱导表达时,温度是影响蛋白表达水平和菌体生长的最主要因素。确定的His-hepcidin诱导表达条件为:含pET-hpc的E.coli BL(DE3)在37℃生长至OD600为0.6～0.8后加入0.2mmol/L IPTG于30℃诱导表达6h。表达后菌体收率为6.1g/L(湿重),His-hepcidin约占菌体总蛋白的25%。收获的菌体经超声破碎后离心分离His-hepcidin包涵体,采用1%浓度的Triton X-100洗涤2次,洗涤后包涵体收率为0.99g/L(湿重),其中包涵体中重组蛋白占总蛋白的76%,His-hepcidin产率为199mg/L。包涵体中半胱氨酸残基主要以还原形式存在,采用含100mmol/L β-ME的8mol/L尿素溶解包涵体。