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风味是果实品质的重要组成部分,主要受可溶性糖和有机酸含量及其比值决定。解析果实糖酸的分子调控机制,探究果实内部有机酸与糖之间的联系对于果实风味品质改良意义重大。苹果果实中苹果酸数量性状位点Ma位点内的苹果酸度调控主效基因Ma1对果实酸度的调控占酸度变化的17%-42%。一般来说,基因型ma1/ma1的苹果在果实成熟时的酸度显著低于基因型Ma1/Ma1或Ma1/ma1的果实。课题组在前期的研究中发现,同为ma1ma1基因型的‘宝斯库普’和‘矮丰’苹果果实酸度却差异很大,经转录组及基因表达分析发现MdWRKY126可能参与苹果果实酸度调控。本论文结合生物信息学和分子手段,揭示了MdWRKY126通过调控胞质中苹果酸脱氢酶基因MdcyMDH5的表达,进而影响着苹果果实酸度的转录调控机理;并基于MdWRKY126和MdcyMDH5过表达苹果愈伤组织和MdcyMDH1过表达苹果果实中糖含量的变化,探究果实内由胞质苹果酸脱氢酶引起的酸变化对糖影响的代谢调控网络,旨在解析果实糖酸的分子调控机制,为改善苹果果实糖酸品质提供新的见解与理论指导。主要研究结果如下:1.转录因子MdWRKY126调控苹果果实酸度的积累。对‘宝斯库普’和‘矮丰’不同发育期果实中苹果酸含量及MdWRKY126表达水平的测定结果显示,MdWRKY126的表达与果实中苹果酸含量正相关。系统发育进化分析显示MdWRKY126是矮牵牛中酸度调控转录因子Ph PH3的同源基因。本研究构建了MdWRKY126植物过表达及干扰载体,利用农杆菌介导法转化‘王林’苹果愈伤组织,‘Micro Tom’番茄以及瞬时转化‘富士’苹果果实。与对照相比,过表达MdWRKY126显著提高了苹果愈伤和果实中的苹果酸的含量,而沉默MdWRKY126则对苹果愈伤组织中有机酸的积累有抑制作用。MdWRKY126在番茄中的异源过表达同样促进了番茄果实中苹果酸及柠檬酸的积累,这些结果表明转录因子MdWRKY126正调控果实酸度积累。2.转录因子MdWRKY126调控的胞质苹果酸脱氢酶基因MdcyMDH5参与苹果果实中苹果酸的积累。基于矮牵牛等物种中的研究进展,分析了MdWRKY126与苹果酸度相关质子泵基因Md PH1和Md PH5的关系,发现它们在苹果中不存在直接的互作关系。进一步分析了MdWRKY126过表达苹果愈伤组织中苹果酸合成和转运相关基因的表达水平。结果显示在MdWRKY126转基因株系中,参与酸调控的3个苹果酸脱氢酶,5个转运蛋白和3个质子泵基因的m RNA表达水平显著上调。对‘矮丰’和‘宝斯库普’苹果果实中上述11个苹果酸调控相关基因的表达水平的分析发现,其中6个基因（MdcyMDH5、MdcyMDH1、Md MDH18、Md TDT1、Md VHA-A3-1和Md AVP3）和MdWRKY126的表达模式类似,在‘宝斯库普’果实中高表达。顺式作用元件预测结果显示,MdcyMDH5、MdcyMDH1、Md AVP3启动子中包含转录因子WRKY结合的顺式作用元件W-Box。经Ch IP-PCR、LUC、Y1H、GUS活性测定等实验证实MdWRKY126能直接结合到MdcyMDH5基因的启动子并激活其转录表达。过表达MdcyMDH5提高了苹果愈伤组织和果实中MDH的活性,并且显著提高了苹果愈伤组织和果实中的苹果酸的含量。在MdWRKY126过表达转基因材料中,利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术沉默掉Md MDH5基因后,由MdWRKY126引起的转基因材料中苹果酸含量的改变得到了恢复。这些结果表明,MdcyMDH5作为MdWRKY126下游直接功能基因参与苹果愈伤和果实中苹果酸的积累。3.胞质苹果酸脱氢酶基因MdcyMDH调控着苹果中蔗糖的积累。我们发现在MdcyMDH5和MdWRKY126转基因愈伤组织和果实中苹果酸积累增加的同时,蔗糖含量明显提高。同时也发现另外一个苹果酸脱氢酶基因MdcyMDH1的过表达能够提高苹果果实中苹果酸和蔗糖的含量。为了进一步探究胞质中苹果酸的积累如何改变苹果果实中蔗糖的含量,我们对野生型和MdcyMDH1过表达转基因苹果果实进行了转录组基因差异表达分析,发现了转基因苹果果实中蔗糖-6-磷酸合成酶（SPS）基因表达水平显著上升,SPS活性也显著增加。类似的,MdcyMDH5和MdWRKY126的过表达同样提高了愈伤组织中Md SPSs基因的表达水平和SPS活性,这可能与转基因材料中增加的蔗糖含量相关。为了验证Md SPSs在胞质苹果酸脱氢酶基因调控苹果果实蔗糖含量中的重要性,在MdcyMDH1过表达苹果果实中,利用VIGS技术分别沉默掉Md SPSB2和Md SPSC2基因,发现由MdcyMDH1引起的转基因材料中蔗糖含量的改变得到了恢复。另外,在MdcyMDH1过表达成熟果实转录组差异表达基因中发现了一些明显上调的淀粉裂解相关基因及糖异生相关基因。这些结果表明,苹果酸脱氢酶可能通过影响淀粉代谢或糖异生途径间接调控SPS活性及相关基因的表达,进而影响蔗糖代谢和果实糖含量。