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酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(ACAT)是细胞内唯一催化游离胆固醇和长链脂肪酸形成胆固醇酯的酶,在维持细胞胆固醇动态平衡中起重要作用。在哺乳动物中,已经鉴定出了两种ACAT基因分别编码ACAT1和ACAT2。其中ACAT2只在肝、肠细胞中特异性表达,而ACAT1在所有已检测的细胞中均表达。ACAT1与某些严重的人类疾病,如动脉粥样硬化和老年痴呆症(AD)等密切相关,并被认为是治疗这些疾病的潜在靶标。在实验室前期研究的基础上,我的博士论文工作主要探索人ACAT1在细胞水平及相关疾病中的作用机理。 ACAT1以游离胆固醇为底物,其合成胆固醇酯进入细胞内脂滴贮存,维持细胞内的胆固醇、脂肪酸等脂质代谢平衡。在第一部分工作主要研究ACAT1对细胞质膜游离胆固醇动态及功能的影响作用。首先,发现抑制ACAT1导致人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH细胞质膜APP-α加工减少。进而,通过使用ACAT1的siRNA与表达质粒进行的转染实验表明,细胞质膜APP-α加工是依赖于ACAT1活性。然后,深入研究发现抑制ACAT1引起细胞质膜游离胆固醇(PM-FC)量增加,并且揭示抑制ACAT1所引起PM-FC量增加而导致APP-α加工减少。这些表明,ACAT1引导人SK-N-SH细胞PM-FC动态进而导致APP-α加工改变。更为重要的是,进一步的实验显示抑制ACAT1所引起PM-FC量及随后导致APP-α加工改变均不依赖细胞TC水平,这进一步证实了ACAT1是人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH的PM-FC动态的主要引导因素,同时提出细胞水平ACAT1功能模型。这些结果为我们提供了一个新的观点,即ACAT1酶活性控制PM-FC动态可能在人神经细胞中起极重要的功能作用。 我们实验室之前的工作揭示肿瘤坏死因子-α(TNF-α)通过NF-κB途径增强人单核细胞ACAT1表达来促进分化之中的单核细胞形成胆固醇酯(CE)堆积细胞。TNF-α和单核细胞在动脉粥样硬化及其导致的冠心病(CHD)和中风发展过程起极重要的作用。在第二部分工作是结合临床样本继续研究血液单核细胞直接形成CE堆积细胞或泡沫细胞的作用机制。首先,通过对100多份血样的分组、进行脂滴染色,发现不管来自高血脂还是正常血脂的CHD病人血液单核细胞都能直接形成CE堆积细胞。进而,测定血样血浆的多种炎症因子,发现CHD病人血浆中炎症因子TNF-α、白细胞介素6(IL-6)和C反应蛋白(CRP)的水平显著高于作为对照的健康志愿者血浆中的量。然而,进一步的体外细胞培养实验表明,仅其中的过量TNF-α与血液单核细胞直接形成CE堆积细胞的潜能正相关,而IL-6和CRP与之无明显的相关性。深入利用人血液单核细胞和单核细胞系THP-1进行机理研究表明,过量TNF-α可激活单核细胞直接形成CE堆积细胞的潜能,且可被抗TNF-α抗体特异性阻断。进而,探索相关的分子机制,揭示了过量TNF-α能通过分别增强功能性粘附分子和清道夫受体来促进单核细胞粘附和摄取氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)。最后,小鼠模型的体内和体外实验结果进一步肯定,过量TNF-α可激活单核细胞直接形成CE堆积细胞的潜能。这些结果表明,血液中过量TNF-α是动脉粥样硬化和CHD发展的最初诱因。 在上述两部分工作中,发现人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH中ACAT1引导细胞质膜游离胆固醇动态进而导致APP-α加工改变;发现血液中过量TNF-α可激活单核细胞直接形成胆固醇酯堆积细胞的潜能。后者工作,不但证实我们实验室前期揭示TNF-α增强分化中单核细胞ACAT1表达而导致胆固醇酯堆积细胞形成的功能机制,而且还揭示了血液中过量TNF-α可提高单核细胞粘附内皮细胞和摄取oxLDL的机制。这些表明ACAT1作为酶通过其底物和产物,对细胞生命活动发挥极重要的功能作用。以上ACAT1在细胞水平的功能机理揭示,有利于深入相关的生理和病理研究、并具有临床应用意义。