论文部分内容阅读
第一章MTDH在头颈鳞癌中的表达及其临床意义目的异粘蛋白(Metadherin, MTDH)是新近发现的癌基因,在大多数肿瘤中高表达,与肿瘤侵袭转移密切相关。然而,其在头颈鳞癌侵袭转移中的作用并不十分清楚。因此,本研究检测MTDH在头颈鳞癌中的表达及临床意义,并初步探讨其在头颈鳞癌侵袭转移中的作用及相关机制。方法免疫组织化学方法检测189例头颈鳞癌石蜡组织标本及27例癌旁粘膜组织中MTDH、上皮-间质转化(Epithelial to Mesenchymal Transition, EMT)标志蛋白E-cadherin及血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)的表达及分布特征,并分析MTDH表达与临床病理参数及预后的关系,以及MTDH表达与E-cadherin、 VEGF表达的相关性。结果1)MTDH蛋白在头颈鳞癌组织中表达上调,且与头颈鳞癌肿瘤原发部位(P=0.033)、T分期(P=0.001)、临床分期(P=0.000)、淋巴结转移(P=0.000)、肿瘤术后复发(P=0.000)密切相关。2)Kaplan-Meier生存分析结果显示MTDH蛋白高表达组患者术后复发和死亡率较低表达组明显增高,5年累积总生存率分别为37.6%与72.6%,5年累积无瘤生存率分别为31.8%和68.6%,log-rank检验证实两组差异有统计学意义(χ2=20.135,P<0.001；χ2=22.058,P<0.001)。多因素回归分析表明,MTDH表达水平是头颈鳞癌患者的独立预后因素。3)Spearman秩相关检测结果显示MTDH表达与E-cadherin表达水平呈负相关(r=-0.336,P<0.001),与VEGF表达呈正相关(r=0.319,P<0.001)。结论1)MTDH蛋白在头颈鳞癌中高表达,其高表达与头颈鳞癌患者的肿瘤发生部位、T分期、临床分期、复发及转移密切相关,并显著影响患者的预后。2)MTDH表达与E-cadherin表达水平呈负相关,与VEGF表达呈正相关,提示MTDH可能调控头颈鳞癌EMT和血管新生。第二章MTDH通过上皮-间质转化调控头颈鳞癌细胞侵袭转移目的前述研究证实MTDH与头颈鳞癌转移和EMT分子标志物E-cadherin密切相关,因此,我们进一步检测MTDH对头颈鳞癌细胞体外迁移侵袭和EMT的调控。方法利用慢病毒载体介导的MTDH表达及沉默质粒转染头颈鳞癌细胞Tu686,建立稳定高表达和沉默MTDH的头颈鳞癌细胞株,相差显微镜下观察细胞形态改变；Western blot检测EMT分子标志物E-cadherin、vimentin表达水平改变；划痕愈合实验、transwell侵袭小室实验检测头颈鳞癌细胞体外迁移及侵袭潜能变化情况。结果建立了稳定高表达和沉默MTDH的头颈鳞癌细胞株及空载体对照细胞株,并分别命名为Tu686MTDHpcDNA(+)(MTDH过表达细胞)、Tu686MTDHpcDNA(-)(转染空载体细胞)、Tu686MTDHRNAi(+)(MTDH沉默细胞)、Tu686MTDHRNAi(-)(转染空载体细胞)。Tu686细胞MTDH蛋白过表达后,细胞间连接松散,细胞形态发生改变,有伪足形成,且E-cadherin表达下降,vimentin表达升高,细胞迁移、侵袭能力增强。48h后Tu686细胞、Tu686MTDHpcDNA(-)细胞、Tu686MTDHpcDNA (+)细胞划痕愈合率分别为15±14%,18±8%,84±15%(P<0.05)。48h后穿过transwell侵袭小室的Tu686细胞、Tu686MTDHpcDNA(-)细胞、Tu686MTDHpcDNA(+)细胞细胞数分别为224±15,214±6,317±8(P<0.05)。而Tu686MTDHRNAi(+)细胞与Tu686MTDHRNAi(-)细胞、Tu686细胞比较,E-cadherin表达升高,vimentin表达检测不到,细胞迁移、侵袭潜能明显降低。48h后Tu686细胞、Tu686MTDHRNAi(-)细胞、Tu686MTDHRNAi(+)细胞的划痕愈合率分别为29±5%,28±6%,9±4%(P<0.05)。48h后穿过transwell侵袭小室的Tu686细胞、Tu686MTFHRNAi(-)细胞、Tu686MTDHRNAi(+)细胞细胞数分别为250±20,241±24,139±12(P<0.05)。结论MTDH可通过EMT调控头颈鳞癌细胞体外迁移侵袭。第三章MTDH调控头颈鳞癌细胞VEGF表达目的血管生成因子调控血管新生在肿瘤侵袭转移过程中起重要作用。前期研究表明MTDH表达与VEGF表达呈正相关。进而,本研究在体外实验检测MTDH对头颈鳞癌中VEGF表达的调控。方法利用慢病毒载体建立稳定高表达和沉默MTDH的头颈鳞癌细胞株基础上,western blot检测VEGF细胞内表达水平改变；酶联免疫吸附法(ELISA)检测VEGF细胞外分泌情况。结果Western blot结果表明MTDH过表达后Tu686细胞VEGF的胞内表达增高,相反,MTDH表达沉默后,Tu686细胞VEGF的胞内表达降低。Elisa结果显示Tu686MTDHpcDNA(+)细胞、Tu686MTDHpcDNA(-)细胞、Tu686细胞上清中VEGF含量(pg/ml)分别为498.65±32.19,324.14±33.66,334.93±42.26,Tu686MTDHpcDNA(+)细胞组与Tu686MTDHpcDNA(-)细胞组、Tu686细胞组比较差异均有统计学意义(P<0.05), MTDH促进Tu686细胞VEGF胞外分泌。MTDH表达被抑制后VEGF胞外分泌降低,Tu686MTDHRNAi(-)细胞、Tu686MTDHRNAi(-)细胞、Tu686细胞上清中VEGF含量(pg/ml)分别为267.71±41.39,427.19±60.47,412.48±35.72, Tu686MTDHRNAi(+)细胞组与Tu686MTDHRNAi(-)细胞组、Tu686细胞组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论MTDH可调控头颈鳞癌细胞VEGF的胞内表达和胞外分泌,提示MTDH可能调控头颈鳞癌血管新生。第四章MTDH通过AKT信号通路调控头颈鳞癌EMT及VEGF表达目的探讨MTDH调控头颈鳞癌EMT及VEGF表达的分子机制。方法利用慢病毒载体建立稳定高表达和沉默MTDH的头颈鳞癌细胞株基础上,western blot检测AKT、p-AKT表达水平；小RNA干扰技术沉默Tu686MTDHpcDNA(+)细胞的AKT表达,western blot、划痕愈合实验、transwell侵袭小室实验分别检测EMT分子标志物(E-cadherin、vimentin)表达水平改变、迁移及侵袭潜能变化情况；Western blot、ELISA实验分别检测VEGF细胞内表达和细胞外分泌情况。结果MTDH过表达后AKT、p-AKT表达增加,相反,沉默MTDH表达后AKT、p-AKT表达降低。siRNA抑制Tu686MTDHpcDNA(+)细胞的AKT表达后,p-AKT表达降低,E-cadherin表达升高,vimentin表达降低,细胞迁移、侵袭能力也降低(78±15%vs11±5%；274±22vs157±22；P<0.05)；同时,western bloth和ELISA实验检测到VEGF的胞内表达及胞外分泌均降低。Tu686MTDHpcDNA(+)细胞组、siRNA组胞外VEGF含量分别为535.27±47.72,255.60±39.89(P<0.05)结论MTDH可激活AKT信号通路,并通过AKT信号通路介导EMT及VEGF表达,进而调控头颈鳞癌侵袭转移。