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植物在生长过程中会受多种不利环境的胁迫。渗透胁迫是影响植物生长及作物产量最主要的环境因素之一。高盐、干旱和冷害都能引起渗透胁迫。近几年研究表明钙离子参与了植物高渗胁迫信号转导。不同的外界刺激可以产生不同的钙信号。钙信号被相应的钙离了结合蛋白捕捉,通过特定的信号转导途径传递。最近在植物中发现的calcineurin B-like(CBL)蛋白是一类钙离了结合蛋白。在拟南芥中过量表达AtCBLl可以提高转基因植株对盐胁迫和干旱的抗性,但是对冷害的抗性却降低了。相反Atcbll的缺失突变体对冷害的抗性有提高,但对盐胁迫和干早则表现出超敏感。由此可见,AtCBL1能识别不同刺激产牛的钙信号,并做出不同的反应。这些反应是通过调节下游特异的基因的表达来实现的。我们的研究目的是用蛋白质组学的方法研究这些受AtCBL1调节的蛋白。采用2-D荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)的技术,通过对野生型(Ws)和突变体(Atcbll mutant)进行高盐处理,对比不同材料的总蛋白图谱,一共找到73个差异表达蛋白点,并用质谱的方法鉴定到了62个蛋白,这其中有些是已知的胁迫盐响应蛋白,有的则是新的信号分了。这些蛋白参与了不同的功能,比如信号转导,ROS清除,能量生产,碳循环,代谢,DNA转录,蛋白加工及以一些结构蛋白。我们对715号蛋白,RACKIC(receptor foractivated C kinase l)进行了更深入的研究。
RACK1(receptor for activated C kinase1)是动物和植物细胞中广泛存在的一类高度保守的WD40 repeat脚手架蛋白。最初的研究中动物RACK1仅仅是被当作蛋白激酶C(PKC)的受体,但是随着对其结构、定位信息的解析尤其是和它相互作用蛋白的发现,RACK1的功能范围是大大地扩展了。RACK1分了量在36kDa左右,结构中包含7个WD40 repeat保守区域,为蛋白一蛋白之间相可作用提供平台。RACKl作为信号分子参与了植物中的很多调控途径。拟南芥RACK1有二个同源基因,分别是RACKlA,RACKlB和RACKlC。RACKIA与RACKIB和RACKIC蛋白之间的同源性达到87%和93%,与人的RACK1也有66%左右序列相同。RACKl被认为是ABA和逆境胁迫响应的负调因了,并且参与了对植物牛长发育的调控。我们的研究表明RAKIC和RACKIBD AtcbII突变体中表达上调表达,并且它们两个基因的表达都受到盐处理的诱导。racklc T-DNA插入突变体表现出盐敏感表型,暗示RACKIC是植物质盐胁迫的正调控因子,而racklb突变体表现出抗盐性增强,暗示RACKlB是植物抗盐胁迫的负调控因子。
软件预测显示拟南RACKI蛋白中有一段序列为SUMO化修饰保守位点。体外试验证明,RACKlB在SUMO E3连接酶AtSIZ1的作用下,可以被SUMO修饰。当RACKlB第272和276位保守氨基酸Lys被Arg替换以后,则无法进行SUMO化修饰。
翻译后修饰(post-translational modification)是存在于真核细胞中蛋白质发挥生物学功能的重要调节机制之一,在生物体中具有十分重要的作用。SUMO(smallubiquitin-like modifier)是一类结构上与泛素相似,广泛存在于真核牛物中的高度保守的蛋白家族,从酵母到人都有分布。SUMO分了由其羧基未端的甘氨酸通过异肽键共价连接到靶蛋白的特定保守序列的赖氨酸上来完成对蛋白质的修饰即为SUMO化修饰( sumoylation)。目前,对SUMO化修饰的研究主要集中在哺乳动物和酵母中,而植物方面还处于起步阶段。AtSUMO1/2与底物蛋白的结合被一些外界刺激如温度(高温或寒冷)、H202,干旱等所诱导,推测SUMO化修饰参与了植物的逆境反应,可能提高了植物对逆境的适应能力。在拟南芥中,逆境胁迫引起的苏木化修饰过程主要是受SUMO E3连接酶AtSIZ1调控。我们的研究表明SIZI基因的缺失导致植物抗盐性显著降低,同时抑制了一些盐诱导基因如RD29A/B,KIN12,RD22和 DR EB2A的表达,暗示SIZI是植物响应盐胁迫反应的正调因了。盐处理能诱导SUMO-蛋白复合物的积累。
总之,在这项工作中,我们运用蛋白质组学的方法研究拟南芥盐胁迫响应,发现了RACK1与CBL-CIPK胁迫信号网络的相关性,初步探索了RACKlB参与植物抗盐反应的机制,分析了蛋白SUMO化修饰参与植物抗盐的调控机理。