论文部分内容阅读
铁载体是由细菌、真菌等微生物或植物在限铁条件下合成并分泌的一种与Fe(Ⅲ)具有高亲和力的低分子量铁螯合剂,用于摄取铁元素。假单胞菌(Pseudomonas)是一类分布广泛、种类繁多、适应性极强革兰氏阴性菌,能产生多种不同结构的铁载体。有研究表明假单胞菌所产生的铁载体不仅能帮助细菌摄取铁,还与菌株的致病性相关联,同时还具有抗生素、抗肿瘤和抗疟疾,金属酶抑制剂等生物活性。东湖假单胞菌(Pseudomonas donghuensis)HYS是本实验室前期从武汉市东湖水域中分离并鉴定的一株在限铁培养基中高产铁载体菌株。前期工作证明HYS产荧光铁载体pyoverdine和非荧光铁载体两种,经鉴定这种非荧光铁载体为7-羟基环庚三烯酚酮(7-hydroxytropolone,简称7-HT),是HYS大量分泌的铁载体。本实验室前期通过转座子插入突变筛选HYS菌株合成7-HT的相关基因,发现影响7-HT合成的基因主要集中在两个基因簇上。通过生物信息学分析,发现基因簇1仅存在包括HYS在内的6株假单胞菌中,具有一定的特殊性;基因簇2与大肠杆菌的苯乙酸代谢基因簇相关基因具有很高的同源性,推测基因簇2为苯乙酸代谢基因簇。本工作将在前期工作的基础上进一步确定基因簇2上基因与7-HT合成的相关性,以及基因paak1与paak2在7-HT合成机制中的功能。为了进一步确认HYS菌株的苯乙酸代谢途径与7-HT合成的相关性。本研究对基因簇2上的相关基因是否能够分解代谢芳香类化合物进行了分析,发现这些基因的缺失菌株均在以苯乙酸为单一碳源的基本培养基上不能生长,而在限铁MKB培养基中额外添加苯乙酸会促进7-HT产生,证实基因簇2参与苯乙酸代谢,且苯乙酸降解途径参与7-HT合成。在对基因簇1和基因簇2上的基因功能进行分析时,发现基因簇1上paak1基因与基因簇2上paak2基因的蛋白序列同源性很高,都编码苯乙酰辅酶A连接酶,推测这两个基因的编码产物可能为同工酶。利用同源重组方法构建了HYS敲除菌株?paak2与?paak1?paak2,并对这几株敲除菌株进行交叉回补以及单一碳源实验,来验证paak1与paak2的功能。发现?paak1菌株不产7-HT,但能在苯乙酸为单一碳源的培养基中生长;?paak2菌株产7-HT,但不能在苯乙酸为单一碳源的培养基中生长;?paak1?paak2菌株既不产7-HT,也不能够在苯乙酸为单一碳源的基本培养基上生长。通过构建交叉回补菌株,发现在?paak1以及?paak1?paak2回补paak1或者过表达paak2都能够回补菌株产7-HT表型;在?paak2以及?paak1?paak2回补paak2或者过表达paak1都能够恢复菌株在以苯乙酸为单一碳源的培养基中生长,但在?paak1?paak2中回补paak1菌株的长势要比回补paak2菌株慢且弱。由此可得出HYS中的paak1与paak2在7-HT合成过程中能够功能互补,paak1主要与7-HT合成相关,paak2主要在苯乙酸分解代谢方面起主要作用。通过检测paak1与paak2的转录水平,发现paak1和paak2在HYS中具有表达差异性,它们的表达都受高铁的抑制。paak1表达量要比paak2高,而且高铁对paak1抑制作用更强烈,这也进一步证实了paak1在7-HT合成中的重要性。对数期(7-HT大量合成的时期)?paak1菌株中基因paak2的转录水平比野生型低10倍左右;当在?paak1中回补paak1以及当菌株培养24 h至稳定期时,paak2的转录水平跟野生型相比没有变化;当在菌株?paak2中检测paak1的转录水平时发现其与野生型相比并没有明显的差异。因此得出结论在HYS培养的对数期即7-HT大量合成的时期,基因paak1与基因paak2成正相关的关系,而在菌进入稳定期后,这种现象将消失,具体机制尚待进一步分析。在实验中还发现乙醇能通过抑制7-HT合成相关基因orf6-9来抑制7-HT的合成,说明不同碳源代谢体系会影响7-HT的合成。综上所述,本研究明确了基因簇2参与苯乙酸代谢,且苯乙酸降解途径参与HYS合成7-HT,这为研究7-HT生物合成途径提供了方向。此外,分别位于两个基因簇上且DNA序列排布甚远的paak1和paak2都与7-HT合成相关,具有表达差异性。其中paak1主要与7-HT合成相关,paak2在苯乙酸分解代谢方面起主要作用。并且paak1和paak2在HYS大量合成7-HT时期具有正相关性。这些结果证实paak1和paak2在HYS中具有互补功能,但又有功能分化作用,这为进一步研究7-HT合成机制提供了指导意义。