研究报道肺癌患者常伴有凝血功能异常和血小板计数增多现象。凝血酶是凝血系统中的一个关键因子，与肺癌发生发展密切相关，由它介导血小板活化对于血栓与止血也非常重要。本课题拟探讨肺癌患者化疗前后凝血、纤溶功能相关指标与血小板参数的变化及其临床意义，并通过体外考察凝血酶对血小板活化、巨核细胞增殖和凋亡的作用，以期阐明肺癌患者易发静脉血栓栓塞的原因，并重点关注凝血酶在血小板和巨核细胞中的作用及机制。　　为分析探讨肺癌患者易发静脉血栓栓塞的原因，我们采用美国Beckman Coulter公司ACL-9000全自动凝血/纤溶分析仪测定60例肺癌患者化疗前后血浆凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)含量和D-二聚体(D-D)水平；同时用Beckman Coulter全自动血液分析仪LH750检测血小板计数(PLT)、血小板压积(PCT)、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)等血小板参数；采用酶联免疫方法检测血浆蛋白C(PC)、游离蛋白S(FPS)、纤溶酶原激活剂抑制物-I(PAI-I)的含量，并以20例健康体检者作为正常对照。结果显示：肺癌患者化疗前与正常对照相比血浆FIB、D-D、PAI-I含量明显升高(P<0.05或P<0.01)，血浆PC、FPS含量明显降低(P<0.05)，PLT、PCT、MPV明显升高(P<0.05)：肺癌患者化疗后与化疗前相比血浆PT、TT、APTT明显缩短(P<0.01)，血浆FIB、D-D含量降低(P<0.05或P<0.01)、PAI-I含量升高(P<0.01)，PC、FPS含量降低(P<0.05)，PLT、PCT、MPV下降(P<0.01)；肺癌患者化疗前、化疗后的凝血、纤溶功能相关指标和血小板参数与患者性别、病理类型、TNM分期、有无转移等临床病理特征之间无显著关联(P>0.05)。以上结果表明：肺癌患者化疗前凝血、纤溶功能和血小板各项指标明显异常于正常人，总体处于高凝、抗凝功能降低、继发纤溶亢进的状态下，化疗可进一步加剧肺癌患者的凝血功能紊乱。由此可见，肺癌患者并发静脉血栓栓塞性疾病涉及凝血、纤溶、血小板功能等多种功能异常，这将为临床肺癌患者的抗血栓并发症的预防和治疗提供理论指导。　　由于凝血酶在凝血通路中处于核心位置，同时是血小板激活的重要因子，而在肺癌患者中血小板数目又明显多于正常人。因而，我们又重点考察了凝血酶在血小板和巨核细胞中的作用及其机制，并特别探讨分析抑癌基因PTEN在其中可能的作用。我们采用免疫印记法检测凝血酶诱导血小板活化后PTEN、Skp2、p27kiPl、p21wafl/cipl和AKT磷酸化水平情况；利用倒置显微镜和姬姆萨染色观察并记录细胞形态学变化；用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)法检测凝血酶对巨核细胞Meg-01增殖活性的影响，确定其量效和时效关系；利用碘化丙锭(propidium iodide，PI)单染和Annexin V-APC/7-AAD双染法分别检测凝血酶刺激后Meg-01细胞周期和凋亡情况；利用Fluo3-AM检测凝血酶刺激后Meg-01细胞钙离子浓度的变化；免疫印记法检测Meg-01细胞中PTEN、p27kipl、p21wafl/cipl、Skp2、CD41b表达和AKT、ERK磷酸化水平、Caspase-3与PARP活化水平的变化情况；以荧光实时定量PCR检测Meg-01细胞中转录因子GATA-1mRNA水平的变化。结果显示：①凝血酶诱导血小板活化后，可下调PTEN、p27kipl、p21wafl/cipl的表达水平，提高Skp2、AKT磷酸化水平，并呈时间和浓度依赖性；②随着凝血酶作用时间的延长，通过细胞形态学观察，发现Meg-01细胞集落增多，胞核明显变大，部分细胞伪足铺展延伸，边缘不规则，出现凹陷或折叠。③凝血酶在0.13、0.25 U/ml两个浓度下能明显促进Meg-01细胞增殖(P<0.05或P<0.01)，随凝血酶浓度的增大(0.5、1、2、4、8 U/ml)和作用时间的延长则出现抑制细胞生长的现象(P<0.05或P<0.01)。④饥饿法诱导成功建立凋亡模型，随凝血酶浓度的增大则明显促进细胞凋亡(0.13、0.25 U/ml除外)。⑤0.5 U/ml凝血酶能使S期的细胞比例降低，而G0/G1、G2/M期细胞比例升高，2 U/ml凝血酶使G0/G1期细胞的比例明显增加，导致细胞G0/G1期阻滞。⑥随凝血酶浓度增加，可导致Meg-01胞内钙离子浓度升高。⑦免疫印记结果显示：随着凝血酶浓度的增加，PTEN的表达量先降低后又升高，p21Wafl/cipl、p27Kipl表达和Caspase-3、PARP活化出现不同程度的上调，AKT、ERK磷酸化水平、Skp2、CD41b表达则先升高后明显下降。⑧通过荧光实时定量PCR发现，随时间延长0.5 U/ml凝血酶刺激可以引起转录因子GATA-1表达升高；2 U/ml凝血酶则引起GATA-1下降。⑨成功构建了PTEN干涉和过表达质粒的Meg-01巨核细胞系。以上结果提示，凝血酶可引起血小板PTEN/P13K/AKT信号分子途径相关蛋白表达变化；同时，在巨核细胞Meg-01中，凝血酶可引起信号通路的改变，这可能与凝血酶促进Meg-01细胞凋亡、抑制其增殖等功能相关。尽管形态学观察，凝血酶显示可诱导Meg-01细胞向血小板分化的迹象，但对GATA-1和CD41b的结果分析不完全支持凝血酶诱导巨核细胞向血小板分化。　　综上所述，肺癌患者体内凝血和抗凝平衡机制被打破。凝血酶可诱导血小板活化，并影响巨核细胞的增殖、凋亡和分化，在这些变化过程中，PTEN及其相关的信号通路有可能发挥重要作用。以上结果将为解答肺癌患者易发血栓性疾病提供支持，也将可能为肺癌患者进行血栓性疾病的预防和治疗提供理论依据。