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猪不仅可以在畜牧生产中作为重要的产肉动物,同时还可以作为良好的模式动物应用于科研。卫星细胞是重要的肌源性干细胞,处于肌纤维基膜与基底膜之间,它的激活、增殖、分化、融合成肌管等一系列成肌过程对肌肉的发育调控具有决定性作用。Notch信号通路和miRNA都参与了调控卫星细胞成肌过程,但是对于二者之间相互作用,共同调控猪骨骼肌卫星细胞(Porcine skeletal muscle Satellite Cells,PSCs)生长发育过程还未见研究报道。Notch1基因主要通过其胞内段N1ICD(Notch1intracellular domain)调节Notch信号通路。因此,本课题组前期构建稳转N1ICD(Notch1intracellular domain)的PSCs模型,并选取增殖期1天和分化期第7天实验处理样品和正常样品进行数字基因表达谱(Digital Gene Expression profile,DGE)和Small RNA测序,研究Notch1基因对PSCs的调控。本研究运用生物信息学手段,对测序数据进行分析,鉴定大量的差异miRNA和基因并构建miRNA-mRNA调控网络,进一步解析Notch信号通路对PSCs增殖和分化的调控网络。本研究的结果如下:1、过表达N1ICD对PSCs增殖的调控通过对增殖期样品(P-N1ICD vs P-Control)的DGE测序数据进行分析,共获得295个差异表达的基因,其中属于Notch信号通路的基因HEYL、HEY1、HES4和JAG1都显著上调,说明过表达N1ICD激活Notch信号通路表达。分别对上调和下调的差异基因进行GO和KEGG分析,结果显示上调的差异基因主要富集于细胞周期和细胞增殖等细胞内生物学过程;下调的差异基因主要富集于细胞粘附和蛋白质降解等细胞外基质过程。结合GO分析结果,基因互作网络分析结果显示11个上调的核心hub基因(AURKA、AURKB、PLK1、CDC20、CCNB1、CDC25B、CCNB3、TGB1、ESPL1和CCNA2),参与细胞周期过程的调控;3个下调的hub基因THBS2、ACTC1和FGF2,其中FGF2为该网络最核心的hub基因,主要参与细胞粘附和迁移等生物过程。以上所有结果表明,过表达N1ICD,产生的差异基因主要参与促进细胞周期抑制细胞外基质相关生物过程,进而促进PSCs的增殖。通过分析P-N1ICD vs P-Control组的小RNA测序数据,共鉴定获得48个差异表达的miRNA,其中已知miRNA和未知miRNA分别为44和4个,其中肌肉特异性miRNA有两个发生显著下调,分别是ssc-miR-206和ssc-miR-133a-5p。由此看出,已知miRNA发挥主要调控作用。参考miRWalk 2.0数据库预测已知mi RNA的靶基因,对靶基因进行KEGG分析,结果发现已知miRNA主要参与MAPK、WNT和胰岛素信号通路等细胞增殖相关的通路,推测差异已知miRNA主要参与PSCs增殖调控。既然差异基因和miRNA都主要参与PSCs增殖的调控,根据mi RNA靶向负调控基因原则,对其进行关联分析,并构建miRNA-mRNA互作网络,获得调控PSCs增殖的重要miRNA-mRNA对。结果发现down mi RNA-up mRNA关联的网络中,最核心的hub miRNA有4个,依次排列为ssc-miR-214、ssc-mi R-423-5p、ssc-miR-149和ssc-miR-1343,它们的靶基因包含3个Notch信号通路重要基因HES4、HEYL和JAG1;最核心的两个hub基因为MKI67和WHSC1,都是ssc-miR-214和miR-10家族4个miRNA(ssc-miR-10、ssc-miR-10a-5p、ssc-miR-125a和ssc-miR-125b)的靶基因。因此,ssc-miR-10、ssc-miR-10a-5p、ssc-miR-125a、ssc-miR-125b、ssc-miR-214与MKI67、WHSC1形成重要的miRNA-mRNA对。同理,在up mi RNA-down mRNA关联的网络中,获得四个hub miRNA(ssc-miR-27a、ssc-mi R-146a-5p、ssc-miR-369和ssc-mi R-221-3p)以及三个hub gene(RUNX1T1、FGF2和ACTC1),其中只有ssc-miR-146a-5p和ssc-miR-221-3p都靶向RUNX1T1、FGF2和ACTC1,而ACTC1没有参与骨骼肌发育过程,因此,推测ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-221-3p与FGF2、RUNX1T1形成重要的miRNA-mRNA对。另外,ssc-miR-27a、ssc-miR-146a-5p和ssc-mi R-221-3p都是靶向RUNX1T1,则ssc-miR-27a、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-221-3p与RUNX1T1也形成重要的miRNA-mRNA对。综合上述所有结果,表明过表达N1ICD后,激活Notch信号通路,主要通过调控细胞周期进而促进PSCs的增殖,该过程获得一些重要的基因、miRNA和miRNAmRNA对。2、过表达N1ICD对PSCs分化的调控通过对分化期样品(D-N1ICD vs D-Control)进行DGE测序,鉴定过表达N1ICD产生13个差异的基因,除了7个猪的新基因外,剩下6个基因包括ACTG2、ADM2、CNN1、EGR1、HSPB7和MAD2L1。经GO注释和文献分析,发现只有EGR1参与骨骼肌卫星细胞发育且主要促进其分化。那么,EGR1的下调表达,推测有利于抑制PSCs分化。同样,对分化期的样品进行小RNA测序,鉴定过表达N1ICD产生13个已知miRNA和3个未知miRNA。经文献分析后,发现只有ssc-miR-214、ssc-miR-146a-5p和ssc-miR-30b-5p参与肌卫星细胞分化且主要抑制其分化。那么,这三个miRNA下调表达,推测有利于促进PSCs的分化,与EGR1结果相反。综上所述,在PSCs的分化期过表达N1ICD,获得一些差异的miRNA和基因,推测Notch信号通路参与猪骨骼肌卫星细胞分化的调控。3、qRT-PCR验证随意从DGE测序结果中选取20个差异基因连同N1ICD进行qRT-PCR验证,发现有18个在两种方法中表达趋势一致。同样,从小RNA测序中选取11个mi RNA进行qRT-PCR验证,发现9个与测序结果保持一致。结果表明,测序数据可靠性高。综上所述,我们从基因和mi RNA两个分子层面上系统地研究了过表达N1ICD对PSCs增殖和分化调控,并通过qRT-PCR验证测序数据的可靠性。我们的研究成果为初步解析Notch信号通路对PSCs和肌肉发育的分子机制提供有价值的参考。