随着人民生活水平的提高及饮食习惯的改变,冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)成为高发的慢性致死性疾病。冠状动脉粥样硬化引起冠状动脉阻塞,导致心肌急性缺血,从而引发心律失常、心肌梗死、心源性休克等相关病症,其中急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是冠心病最严重的临床表现。药物溶栓、冠状动脉旁路搭桥术、经皮冠状动脉血管成形术等广泛应用于临床,可治疗急性心肌梗死,恢复血供。但是恢复冠状动脉的血流供应后,心肌的损伤更加严重,即心肌缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤。如何有效防治和处理心肌缺血再灌注损伤以及研究缺血再灌注损伤的机制是目前研究的热点。针对缺血再灌注损伤的研究,1986年Murry首先提出了心肌细胞的一种自我防御性保护机制即心肌缺血预适应(ischemic preconditioning,IPC),即短暂性的缺血缺血后处理可以提高心肌对随后更长时间的缺血和再灌注损伤的耐受能力。然而,缺血缺血后处理的安全性、操作性及个体差异等问题使IPC的临床应用受到限制。因此人们提出了药物缺血后处理(pharmacologic postconditioning,PPC),即模拟IPC通过多种药物减弱心急缺血再灌注损伤的方法。维生素C(Vitamin C,VC)是一种在临床上广泛应用的抗氧化剂。有研究表明IPC对心肌细胞的保护作用与氧自由基产生减少有关。心肌缺血再灌注产生大量的氧自由基引起心肌损伤。维生素C可以减少氧自由基的生成,对细胞膜损伤有一定的保护作用。已研究显示维生素C可减轻骨骼肌、肾和肺的缺血再灌注损伤,而且可以减轻骨骼肌的水肿和骨骼肌的坏死,但是对于心肌保护作用及其机制的研究较少。在本研究中,我们探讨维生素C缺血后处理是否对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,并且进一步研究其保护机制。实验内容主要包括以下两部分:第一部分维生素C缺血后处理对离体大鼠心脏缺血再灌注损伤的保护作用及其作用机制研究目的:探讨维生素C缺血后处理对离体大鼠全心脏缺血再灌注损伤是否具有保护作用,以及其对线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,m PTP)和线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channels,mito KATP,channels)的影响作用。方法:利用主动脉逆行灌注(Langendorff)心脏离体模型,全心缺血30min,再灌注120min,检测心肌梗死面积、血流动力学、灌流液中乳糖脱氢酶(LDH)的含量、心肌组织ATP和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)含量并观察心肌超微结构。利用m PTP开放剂LND和mito KATP通道阻断剂5-HD探讨m PTP和mito KATP通道在VC保护心肌缺血再灌注损伤中的作用。SD大鼠离体心脏随机分成以下7组:1 control组:心脏持续K-H缓冲液灌注;2 I/R组:全心缺血30 min和120 min再灌注;3 VC组:,全心缺血30 min后给予VC 2μM灌流30 min,120 min再灌注;4 VC+5-HD组:首先给予5-HD(100μM)灌流20 min,然后全心缺血30 min后给予VC(2μM)30min,最后再灌注120 min;5 VC+LND组:首先全心缺血30 min,然后给予VC(2μM)灌流30min,在再灌注开始时刻,给予LND(30μM)灌流20 min,接着继续再灌注100 min;6 5-HD组:给予5-HD(100μM)灌流20 min,然后K-H缓冲液灌流30 min,行全心缺血30 min,再灌注120 min;7 LND组:全心缺血30 min,在再灌注开始时刻,给予LND(30μM)灌流20 min,接着继续再灌注100 min。结果1 VC对缺血再灌注后心肌梗死面积的影响与I/R组相比,VC缺血后处理15 min、30 min、60 min明显减少心肌梗死面积(P<0.05)。VC缺血后处理120 min与I/R组相比无统计学差异(P>0.05)。VC缺血后处理30 min心肌梗死面积降低最多(P<0.05),说明VC最佳保护作用的用药时间为30 min。与I/R组相比,四种不同浓度0.5μM,1μM,2μM和10μM的VC缺血后处理均明显减少心肌梗死面积(P<0.05)。其中,2μM的VC缺血后处理心肌保护作用最佳。VC与5-HD或LND联合应用未能减少心肌梗死面积的作用(P<0.05),并且单独给予5-HD或LND对心肌梗死面积无明显影响(P>0.05)。2 VC对血流动力学的影响7个实验分组的离体心脏平衡期血流动力学指标之间没有明显统计学差异(P>0.05)。大鼠离体心脏缺血再灌注后,左心室收缩压(LVDP)、心率(HR)、左心室压力变化最大速率(dp/dtmax)和左心室压力变化最小速率(-dp/dtmin)均比平衡期降低,而左心室舒张末压(LVEDP)与平衡期相比有所升高(P<0.05)。VC(2μM)缺血后处理组血流动力学的各项指标均优于I/R组(P<0.05),表明左心室收缩和舒张功能得到改善。然而,VC与5-HD或LND联合应用时不具有对心功能的保护作用(P<0.05)。5-HD或LND单独使用时对缺血再灌注后的心功能指标的改善没有明显影响。3 VC对LDH的影响I/R组心脏再灌注后灌流液中LDH活性与control组相比明显上升(P<0.05)。VC缺血后处理可显著降低LDH活性(P>0.05)。VC与5-HD或LND联合应用时,均阻碍了VC降低LDH活性的作用(P<0.05)。与I/R组比较,单独给予5-HD或LND对LDH活性无明显影响(P>0.05)。4 VC对心肌内ATP水平的影响I/R组与control组相比,ATP水平显著降低(P<0.05)。与I/R组相比,VC缺血后处理组的心肌内ATP水平显著升高,5-HD或LND抑制VC升高ATP的效果。单独给予5-HD或LND对ATP水平无明显影响。5 VC对m PTP的影响心肌再灌注结束后,I/R组及药物处理组心肌NAD+含量远低于control组(P<0.05)。与I/R组相比,VC缺血后处理组NAD+水平显著升高(P<0.05),表明VC缺血后处理可以抑制m PTP开放从而阻止NAD+降低。VC与5-HD或LND联合使用时阻碍了VC对m PTP开放的抑制作用。单独使用5-HD或LND不影响缺血再灌注后心肌NAD+水平。6心肌细胞超微结构的变化I/R组心肌细胞重度水肿,基质出现空泡,肌膜明显肿胀,肌原纤维粗细不均。线粒体明显肿胀,内呈空泡状,嵴稀疏、变短、断裂。糖原颗粒数量明显减少。VC缺血后处理显改善心肌细胞超微结构变化。但是LND或5-HD抑制了VC的保护作用。结论1在离体Langendorff心脏缺血再灌注模型中,维生素C缺血后处理减少缺血再灌注后心肌梗死面积,并且在2μM浓度缺血后处理30min条件下,维生素C发挥最大的心肌保护作用。2维生素C缺血后处理改善缺血再灌注后心肌的血流动力学,减少缺血再灌注后LDH水平,。3维生素C缺血后处理增加了缺血再灌注后心肌组织ATP的含量,改善心肌能量代谢。4维生素C缺血后处理增加了缺血再灌注后心肌组织NAD+的含量,抑制m PTP的开放。5维生素C缺血后处理明显减轻线粒体的超微结构的病理改变,降低了心肌细胞的损伤程度。6维生素C的上述作用可被mito KATP通道的阻断剂5-HD或m PTP的开放剂LND取消。说明维生素C的心肌保护作用是通过活化mito KATP通道和抑制m PTP开放介导的,并且mito KATP通道可能位于m PTP的上游。第二部分维生素C缺血后处理对大鼠原代培养心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤的保护作用目的:研究维生素C缺血后处理对原代乳鼠心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤是否具有保护作用。方法:从出生1-3 d SD大鼠分离培养原代心肌细胞。建立体外氧糖剥夺再灌注细胞模型,心肌细胞经历氧糖剥夺10 h,再灌注3 h。实验分组1 control组:应用含10%FBS的DMEM培养基,于5%CO2 37℃培养箱中培养。2 OGD/R组:氧糖剥夺10 h,再灌注3 h。3 VC组:在进行OGD后,加入终浓度为2μM的VC与细胞孵育3 h,弃原培养液,用无糖DMEM清洗细胞2次,然后进行再灌注。4 VC+5-HD组:首先给予细胞5-HD 100μM孵育20 min,然后弃培养液,用无糖DMEM清洗细胞2次,然后进行氧糖剥夺,最后换为终浓度为2μM的VC与细胞孵育3 h,恢复再灌注。5 VC+LND组:首先进行氧糖剥夺10 h,加入终浓度为2μM的VC与细胞孵育3 h,用无糖DMEM清洗细胞2次。在恢复氧气和糖供应时,更换为含有30μM LND的正常培养基,孵育20 min后,用正常DMEM培养基清晰细胞2次,然后换为含10%FBS的DMEM培养基,在5%CO237℃培养箱中继续培养160 min,共计3 h。6 5-HD组:在进行氧糖剥夺前,给予细胞100μM的5-HD孵育20min,弃去培养基,用正常的DMEM培养基清洗细胞2次,然后继续正常培养,共计3 h,之后进行OGD/R。7 LND组:细胞进行氧糖剥夺,在恢复氧气和葡萄糖供应的时候,更换为含有30μM LND的正常培养基,孵育20 min后,用正常DMEM培养基清晰细胞2次,然后换为含10%FBS的DMEM培养基,在5%CO237℃培养箱中继续培养160 min,共计3 h。心肌细胞再灌注结束后,利用MTT法测定心肌细胞活力,测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量从而判断细胞受损程度。利用流式细胞技术及激光扫描共聚焦显微镜技术测定细胞中的活性氧ROS,利用激光扫描共聚焦显微镜技术测定m PTP开放情况、胞浆内钙浓度、线粒体内钙浓度、线粒体膜电位。结果1 VC缺血后处理对心肌细胞活力的影响MTT实验结果显示VC缺血后处理1 h,3 h,6 h,12 h,24 h,48 h,心肌细胞活力相比于OGD/R组均有显著性差异(P<0.05)。其中VC缺血后处理3 h的心肌保护作用最佳。0.1μM,1μM,2μM和10μM的VC缺血后处理与OGD/R组相比,心肌细胞回礼均有显著性差异(P<0.05)。其中,2μM的VC缺血后处理心肌保护作用最佳。5-HD(mito KATP通道阻断剂)或LND(m PTP开放剂)与VC的联合应用取消了VC增加心肌细胞活力的作用(P<0.05)。与OGD/R组比较,单独给予5-HD或LND对心肌细胞活力无明显影响(P>0.05)。2 VC对氧糖剥夺再灌注(OGD/R)心肌细胞LDH的影响与control组(10.25±1.84%)相比,OGD/R组(46.71±4.51%)心肌细胞上清液中LDH水平明显上升(P<0.05)。与OGD/R组相比,VC缺血后处理组(26.90±3.36%)LDH水平显著降低(P<0.05)。5-HD或LND与VC联合应用时,均阻断了VC降低LDH的作用(P<0.05)。与OGD/R组比较,单独给予5-HD或LND对LDH水平无明显影响(P>0.05)。结论1 VC缺血后处理增强OGD/R后心肌细胞活力。2 VC降低氧糖剥夺再灌注(OGD/R)心肌细胞LDH的释放。第三部分维生素C缺血后处理对大鼠原代培养心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤的保护作用的机制探讨目的:研究线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,m PTP)和线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channels,mito KATP,channels)在维生素C缺血后处理对原代乳鼠心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤中心脏保护的作用。方法:从出生1-3 d SD大鼠分离培养原代心肌细胞。建立体外氧糖剥夺再灌注细胞模型,心肌细胞经历氧糖剥夺10 h,再灌注3 h。实验分组1 control组:应用含10%FBS的DMEM培养基,于5%CO2 37℃培养箱中培养。2 OGD/R组:氧糖剥夺10 h,再灌注3 h。3 VC组:在进行OGD后,加入终浓度为2μM的VC与细胞孵育3 h,弃原培养液,用无糖DMEM清洗细胞2次,然后进行再灌注。4 VC+5-HD组:首先给予细胞5-HD 100μM孵育20 min,然后弃培养液,用无糖DMEM清洗细胞2次,然后进行氧糖剥夺,最后换为终浓度为2μM的VC与细胞孵育3 h,恢复再灌注。5 VC+LND组:首先进行氧糖剥夺10 h,加入终浓度为2μM的VC与细胞孵育3 h,用无糖DMEM清洗细胞2次。在恢复氧气和糖供应时,更换为含有30μM LND的正常培养基,孵育20 min后,用正常DMEM培养基清晰细胞2次,然后换为含10%FBS的DMEM培养基,在5%CO237℃培养箱中继续培养160 min,共计3 h。6 5-HD组:在进行氧糖剥夺前,给予细胞100μM的5-HD孵育20min,弃去培养基,用正常的DMEM培养基清洗细胞2次,然后继续正常培养,共计3 h,之后进行OGD/R。7 LND组:细胞进行氧糖剥夺,在恢复氧气和葡萄糖供应的时候,更换为含有30μM LND的正常培养基,孵育20 min后,用正常DMEM培养基清晰细胞2次,然后换为含10%FBS的DMEM培养基,在5%CO237℃培养箱中继续培养160 min,共计3 h。心肌细胞再灌注结束后,利用流式细胞技术及激光扫描共聚焦显微镜技术测定细胞中的活性氧ROS,利用激光扫描共聚焦显微镜技术测定m PTP开放情况、胞浆内钙浓度、线粒体内钙浓度、线粒体膜电位。结果1 VC缺血后处理对m PTP开放程度的影响与control组相比,OGD/R组(26.89±1.62%)心肌细胞荧光强度明显减弱(P<0.05)。VC缺血后处理组荧光强度(83.97±3.05%)明显高于OGD/R组(P<0.05)。VC+5-HD组(29.80±2.43%)和VC+LND组(29.17±3.45%)的荧光强度显著低于VC组,表示5-HD或LND取消了VC缺血后处理对m PTP开放的抑制作用。5-HD组(28.07±2.90%)和LND组(27.17±2.82%)的荧光强度与OGD/R组比较无明显差异。2 VC缺血后处理对ROS的影响与control组相比,OGD/R组(557.93±47.44%of control)心肌细胞内ROS水平显著升高(P<0.05),VC缺血后处理组(286.65±30.90%of control)心肌细胞ROS水平较OGD/R组下降(P<0.05)。VC与5-HD或LND联合应用后,心肌细胞内的ROS水平增加,说明5-HD或LND阻断了VC降低ROS的效果。单独给予5-HD和LND对细胞内ROS水平无明显影响。3 VC缺血后处理对钙浓度的影响本实验运用钙离子敏感探针Fluo-4或Rhod-2分别观察细胞内和线粒体内钙浓度的变化。荧光强度的变化与钙浓度呈正比。相比control组,OGD/R组胞浆和线粒体内荧光强度(392.17±24.11%of control,236.31±31.87 of control)显著增加(P<0.05),表明胞浆和线粒体内Ca2+浓度明显升高,产生钙超载。VC缺血后处理组后荧光强度(137.28±20.38of control,125.21±22.76 of control)较OGD/R组明显减弱,表明VC缺血后处理可抑制OGD/R所导致的钙内流,减轻钙超载。VC抑制钙内流的效果可被5-HD或LND所抑制。单独给予5-HD或LND对减轻钙内流无明显效果。4 VC缺血后处理对线粒体膜电位的影响利用激光扫描共聚焦显微镜技术检测TMRE荧光的变化,进而评估线粒体膜电位的情况。相对于control组,OGD/R组(34.39±3.71%of control)的荧光强度明显减少,表明了线粒体膜电位的下降。VC缺血后处理(84.00±4.50%of control)较OGD/R组的TMRE荧光强度明显降低,表明VC缺血后处理减少了线粒体膜电位的下降。VC+5-HD组(35.60±3.46%of control)和VC+LND组(34.31±3.60%of control)的TMRE荧光强度较VC组明显减弱,说明5-HD或LND抑制了VC维持线粒体膜电位的作用。5-HD组(32.49±2.02%of control)和LND组(30.81±2.46%of control)较OGD/R组没有明显变化,表明,5-HD和LND不能减轻线粒体膜电位的变化。结论1维生素C缺血后处理降低OGD/R后m PTP的开放程度。2维生素C缺血后处理减少OGD/R后ROS产物,减轻氧化应激。3维生素C缺血后处理降低OGD/R后细胞内及线粒体内钙浓度,减轻钙超载。4维生素C缺血后处理减少OGD/R后线粒体膜电位的下降,维持线粒体膜电位。5维生素C的上述作用可被mito KATP通道的阻断剂5-HD或m PTP的开放剂氯尼达明(lonidamine,LND)抑制。维生素C的心肌保护机制可能是通过减少ROS活化mito KATP通道,减少钙超载,进而抑制m PTP的开放及线粒体膜电位的去极化。