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马立克氏病(Marek′s disease,MD)是由鸡的马立克氏病病毒(Marek′s disease virus,MDV)所引起鸡的一种淋巴组织增生性肿瘤病,具有较高的发病率和死亡率。随着MDV毒力的增强,其疫苗的免疫压力逐渐增大,不断有报道超强毒株能够突破现有疫苗CVI988的免疫保护,因此亟需研究MDV的致病机制以更有效的防治MD。PI3K/Akt信号转导通路作为细胞内重要的信号转导通路之一,在调控机体生物学活动方面发挥重要作用,尤其在多种病毒的感染过程中存在调控作用,但其在MDV感染中的研究还未见报道。因此,探索PI3K/Akt信号通路在MDV感染过程中能否被激活以及其在MDV感染过程中所发挥的作用,对于进一步揭示MDV的致病机制具有积极的意义。本研究所用病毒为马立克超强毒株Md5,将其体外感染CEF细胞,并利用荧光定量PCR方法从基因表达水平分析感染后不同时段的PI3K基因表达变化规律,结果显示,在感染MDV后CEF细胞内PI3K基因的表达量呈现上升趋势。接着,利用Western blot方法从蛋白质表达水平检测Akt磷酸化水平,我们发现,Akt的磷酸化水平在4 hpi(hours post-infection)显著升高,直至60 hpi仍能检测到较高水平的磷酸化Akt。LY294002作为PI3K的一种特异性抑制剂,用其处理细胞后再感染MDV,经Western blot检测发现,Akt磷酸化水平被显著性抑制。上述结果表明,PI3K/Akt信号通路在MDV体外感染CEF细胞的过程中被激活。为了明确PI3K/Akt信号转导通路对MDV复制增殖的影响,本研究将抑制接毒组细胞(即使用抑制剂LY294002作用后再感染MDV的CEF细胞),与未使用抑制剂的正常接毒组细胞分别进行病毒滴度测定,结果显示,在感染后的不同时间段,抑制接毒组的病毒滴度均明显低于正常接毒组。为了进一步验证该结果,本研究建立起以Meq为靶基因的Real-time PCR检测方法,通过检测发现,抑制接毒组的Meq基因转录水平明显低于正常接毒组,综上表明,PI3K/Akt信号转导通路对MDV的复制增殖具有明显的促进作用。PI3K/Akt信号通路自身作用的发挥主要依赖于对下游多种因子活性的调控,因此本研究选取PI3K/Akt信号通路的下游关键因子进行检测。首先对MDV感染是否激活PI3K/Akt/GSK-3β通路进行Western blot测定,结果显示,MDV感染不同时段均检测到磷酸化的GSK-3β,且当抑制了PI3K/Akt信号通路时,磷酸化GSK-3β的蛋白表达水平明显下调,由此可知,MDV感染能够激活PI3K/Akt/GSK-3β信号通路。此外,我们利用荧光定量PCR技术观察PI3K/Akt下游关键因子GSK-3β、mTOR、p53、Bad表达量的变化规律。结果显示,抑制接毒组细胞内p53、mTOR的表达量与正常接毒组相比差异不显著。而GSK-3β与Bad基因的表达量则具有显著差异,且与正常接毒组相比,表现为显著上调。因此我们猜测,GSK-3β与Bad基因可能参与到MDV感染CEF细胞的病毒复制增殖过程中。该研究结果有利于进一步揭示病毒感染与宿主细胞的互作机制,有利于深入理解MDV的感染及致病机制,为MD的防控提供新的方法和思路。