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实验背景及目的:急性心肌梗死是全世界范围内致死及致残的主要病因之一。对于急性心肌梗死的患者,及时的恢复梗死冠脉的血流灌注对于缩小心梗面积、保存左室收缩功能、防止心衰发生,改善预后具有重要意义。然而,再灌注本身可导致额外的心肌损伤,即缺血/再灌注损伤(I/RI)。I/RI可引起心肌收缩功能障碍及细胞损伤,抵消血管再通后血流恢复所带来的临床受益,目前尚无有效的防治措施。促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)作为一种调节哺乳动物红细胞生成、刺激红系造血的细胞活性因子,目前被广泛地应用于临床上各种原因所致的贫血的治疗。既往研究表明,除造血作用外,EPO还可对心脏、肾脏、大脑等多组织器官发挥保护作用。大量证据亦证明,EPO可减少缺血/再灌注相关的组织损伤,如心肌梗塞、出血性休克、急性肾损伤等。然而EPO本身的促红细胞生成、促血栓形成等副作用极大地限制了其临床应用推广。Brines等通过分析EPO的空间构象,合成了一种可以和EPO组织保护受体(EPOR-βc R)特异性结合的线性多肽链(Helix B-surface peptide,HBSP),此多肽链由11个氨基酸残基组成;在糖尿病大鼠视网膜病变模型、大鼠中风模型、啮齿类动物坐骨神经挤压伤等多个动物模型中,此多肽均发挥了与EPO相似的组织保护作用,并且没有EPO促红细胞生成等不良反应的发生。本课题组前期研究结果亦证实,HBSP可显著抑制大鼠心肌缺血/再灌注损伤,减少梗死面积。但是HBSP对I/RI的心肌微血管内皮细胞(CMECs)是否具有保护作用及其可能涉及的机制并未见报道。本研究旨在通过建立模拟缺血/再灌注模型,观察HBSP对于缺血/再灌注的CMECs是否有保护作用,并进一步探讨其具体机制。实验方法:分离培养大鼠CMECs,建立模拟缺血/再灌注(SI/R)损伤模型,随机分为对照组(Con组)、模拟缺血/再灌注组(SI/R组)、模拟缺血/再灌注+重组人促红细胞生成素(rh EPO,10 IU/ml)组、模拟缺血/再灌注+HBSP组;HBSP组分别选择2.5、25、50、100ng/ml浓度,通过MTT比色法及TUNEL法分别检测细胞增殖能力及凋亡率,以确定药物作用的最适浓度。确定最适浓度后采取细胞划痕实验及Transwell小室法检测细胞迁移能力,进一步验证HBSP对于CMECs的作用。为了研究HBSP的保护机制,我们将实验分为5组:对照组(Con组)、模拟缺血/再灌注组(SI/R组)、模拟缺血/再灌注+HBSP(最适浓度25ng/ml)组、SI/R+HBSP+PI3K抑制剂LY294002组、SI/R+HBSP+Rapamycin组。其中m TOR为Akt下游分子,Rapamycin为其特异性抑制剂。采用Western blot法检测Akt及磷酸化的Akt、m TOR及磷酸化的m TOR、p70S6K及磷酸化的p70S6K蛋白的表达,采取TUNEL法检测CMECs的凋亡。结果:1、成功地分离和培养了心肌微血管内皮细胞,并构建了SI/R模型。2、与对照组(Con组)相比较,SI/R组CMECs增殖能力明显降低(P<0.01),凋亡率显著上升(3.54%±0.21%vs.41.1%±0.8%,P<0.01),迁移能力下降。与SI/R组比,rh EPO组和HBSP组增殖能力明显上升(P<0.05),凋亡率显著下降(P<0.01),HBSP组迁移能力增强(P<0.01)。3、用PI3K特异性抑制剂LY294002及m TOR特异性抑制剂Rapamycin分别对细胞进行干预后,结果显示:与SI/R组相比,HBSP组Akt磷酸化水平、m TOR磷酸化水平及p70S6K的磷酸化水平均显著提高(P<0.05),细胞凋亡率下降(P<0.01);与SI/R+HBSP组相比,SI/R+HBSP+LY294002组Akt磷酸化水平、m TOR磷酸化水平及p70S6K磷酸化水平均显著下降(P<0.05),SI/R+HBSP+Rapamycin组m TOR磷酸化水平及p70S6K磷酸化水平显著下降(P<0.05)。与SI/R+HBSP组相比,此两组细胞凋亡率均增加(P<0.05)。结论:HBSP可显著抑制I/R诱导的CMECs凋亡,促进CMECs存活,提高迁移能力,改善细胞功能,其保护作用可能与PI3K/Akt/m TOR信号通路的激活有关。