目的锰(Manganese, Mn)作为机体必需的微量元素之一,在体内可以参与构成许多酶的活性基团或辅助因子,同时又是某些酶的激活剂,参与许多生物化学反应,但是过量的锰进入体内则会引起锰中毒。进入体内的锰可穿透血-脑屏障,蓄积在脑组织内,早期主要表现为神经行为功能的改变,长期过量接触锰主要表现为锥体外系损伤,出现类似帕金森氏综合征的症状。因此,关于锰的神经毒性研究备受广大学者的关注。对锰神经毒作用机理的研究至今尚未完全阐明,锰的神经毒作用涉及诸多方面：过量的锰可增加神经细胞的代谢,破坏线粒体,提高溶酶体活性,发生自消化作用,引起神经细胞退变及损伤,还可激活细胞色素氧化酶P-450活性而产生自由基。近年来研究表明,锰可干扰脑内的兴奋性神经递质谷氨酸的代谢而产生间接兴奋性神经毒作用。作为兴奋性氨基酸神经递质受体之一的N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR)具有独特的结构功能特点,它既是配体门控受体,又是电压依赖性门控受体,因而在神经生理、病理和毒理学研究中NMDA受体也受到了特别关注。MK-801是一种强有力NMDA受体非竞争性拮抗剂,易通过血脑屏障,可作用于NMDA受体通道内部的苯环哌啶位点进行别构调节,能有效阻滞谷氨酸与突触后膜受体结合,阻断NMDA受体偶联的ca2+通道激活,使Ca2+内流减少,从而使NMDA受体作用减弱。为了进一步了解锰对兴奋性神经递质代谢的影响与神经细胞损伤的关系,以及MK-801对锰神经毒性的防护作用。我们将从体内和体外实验两方面研究如下问题：①锰对谷氨酸代谢的影响,②锰对NR1、NR2A和NR2B亚单位表达的影响,③锰对原代培养神经元的毒性作用,④MK-801对锰致神经损伤的防护作用。这将对我们进一步了解锰神经毒性的具体机制有十分重要的意义,将为锰致神经细胞损伤的发病机理和防治提供重要理论和实验依据。实验方法一、体内动物实验(一)实验动物与分组由中国医科大学实验动物中心提供的实验用Wistar大鼠100只,体重170～190g,雌雄各半。正式实验前饲养7d,然后按体重随机分成5组,每组20只。第1组为对照组,腹腔注射0.9%氯化钠,第2-4组为锰染毒组,分别腹腔注射8,40,200μmol/kg的氯化锰溶液,第5组为MK-801预处理组,隔日皮下注射0.3μmol/kg的MK-801溶液,2h后腹腔注射200μmol/kg的氯化锰溶液,注射容量均为5 ml/kg。每周注射5次,共4周。(二)测定指标1、脑纹状体锰含量的测定染毒4周后,每组处死8只大鼠,取出一定量的纹状体组织,用原子吸收分光光度火焰法测定Mn含量。2、脑纹状体Glu和Gln含量的测定染毒4周后,每组处死6只大鼠,取出一定量的纹状体组织,按南京建成试剂盒说明书操作,测定Glu和Gln含量。3、脑纹状体PAG和GS活力的测定染毒4周后,每组处死6只大鼠,取出一定量的纹状体组织,分别按Curi禾(?)Renis描述的方法测定PAG和GS活力。4、脑纹状体NMDA受体mRNA和蛋白表达的测定每组取4只大鼠纹状体组织,分别用RT-PCR和Western blot方法检测mRNA和蛋白的表达,按常规方法提取总RNA和总蛋白,检测NR1,NR2A和NR2B的mRNA表达,用G3PDH作内参；检测NR1, NR2A和NR2B的蛋白表达,用β-actin作内参,用凝胶成像分析系统照相,测定各条带的灰度值。5、细胞凋亡的测定每组4只大鼠取一定量纹状体组织,制成单细胞悬液后,用流式细胞仪检测细胞凋亡率；每组2只大鼠用4%的多聚甲醛灌流固定,取出纹状体进一步处理后,电镜观察神经元细胞凋亡。二、体外神经元细胞培养(一)神经元培养取新生鼠脑,去脑膜后切碎,用胰蛋白酶消化后,将细胞悬液转移到200目筛网中过滤,以含有10%马血清的DMEM培养基稀释细胞悬液至1×106／1.5m1,接种于经多聚赖氨酸过夜处理的直径为60mm的培养皿中,置于37℃CO2孵箱中培养24 h后,吸去DMEM培养基,换成无血清的Neurobasal培养液继续培养。加入阿糖胞苷,抑制非神经元的增值和生长。(二)神经元的鉴定倒置显微镜观察神经元表面光滑,胞体大、饱满,呈锥体形、星形、多角形或不规则形,突起清晰,均匀细长,2-5个不等,突起之间相互交织成网,连结紧密。用免疫细胞化学的方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)。(三)测定指标1、细胞活力测定待细胞生长状态最佳时加入含锰的培养液,锰处理浓度分别为0,12.5,25,50,100,200,400μmol/L7个组,MK-801预处理组,用10μmol/L MK-801预处理30 min后,再用400μmol/L氯化锰处理神经元,分别培养6、12、24、48 h后,用MTT法测定细胞活力。2、培养液中LDH活力的测定神经元细胞用锰处理浓度分别为0,12.5,25,50,100,200,400μmol/L7个组,MK-801预处理组,用10μmol/L MK-801预处理30 min后,再用400μmol/L氯化锰处理神经元,分别培养6、12、24、48 h后,用比色法测定LDH活力。3、TUNEL法检测细胞凋亡神经元细胞用锰处理浓度分别为0,25,100,400μmol/L4个组,MK-801预处理组,用10μmol/L MK-801预处理30 min后,再用400μmol/L氯化锰处理神经元,培养12h后,按原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行凋亡细胞染色,分析细胞凋亡率。4、神经元细胞NMDA受体mRNA和蛋白表达的测定神经元细胞用锰处理浓度分别为0,25,100,400μmol/L 4个组,MK-801预处理组,用10μmol/L MK-801预处理30 min后,再用400μmol/L氯化锰处理神经元,培养12h后,分别用RT-PCR和Western blot方法检测mRNA和蛋白的表达,按常规方法提取总RNA和总蛋白,检测NR1, NR2A和NR2B的mRNA表达,用G3PDH作内参；检测NR1, NR2A和NR2B的蛋白表达,用β-actin作内参,用凝胶成像分析系统照相,测定各条带的灰度值。5、神经元细胞内Ca2+浓度的测定神经元细胞用锰处理浓度分别为0,25,100,400μmol/L4个组,MK-801预处理组,用10μmol/L MK-801预处理30 min后,再用400μmol/L氯化锰处理神经元,培养12h后,用双波长荧光分光光度计检测。6、神经元Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力的测定神经元细胞用锰处理浓度分别为0,25,100,400μmol/L4个组,MK-801预处理组,用10μmol/L MK-801预处理30 min后,再用400μmol/L氯化锰处理神经元,培养12h后,提取膜蛋白用比色法测定。实验结果一、体内动物实验1、脑纹状体锰含量随着染锰剂量的增加,纹状体Mn含量也逐渐升高。各染锰组纹状体Mn含量均明显高于对照组(P<0.05),200μmol/kg染锰组大鼠纹状体Mn含量达到最高值0.98±0.27μg／g组织湿重,是对照组的4.7倍(P<0.01)。MK-801预处理组Mn含量与200μmol/kg染锰组比较,无明显变化。2、脑纹状体Glu和Gln含量随着染锰剂量的增加,Glu含量逐渐升高,Gln含量逐渐下降。200μmol/kg染锰组与对照组比较,Glu含量明显升高2.5倍；Gln含量明显下降了39.4%(P<0.01)。MK-801预处理组与200μmol/kg染锰组比较,Glu含量下降不明显,Gln含量明显回升了36.8%(P<0.05)。3、脑纹状体PAG和GS活力随着染锰剂量的增加,PAG活力逐渐升高,GS活力逐渐下降。200μmol/kg染锰组与对照组比较,PAG活力明显升高了54.4%达到41.02±6.60μmol/min/g protein; GS活力明显下降了28.9%达到.44.47±6.93μmol/min/g protein(P＜0.01)。MK-801预处理组与200μmol/kg染锰组比较,PAG活力明显下降,GS活力明显回升。4、脑纹状体NMDA受体mRNA和蛋白表达随着染锰剂量的增加,NR1, NR2A, NR2B mRNA和蛋白的表达均有不同程度的下降,其中NR2A灰度值下降最明显。MK-801预处理组与200μmol/kg染锰组比较,NR2A的灰度值明显升高(P<0.05),NRl和NR2B灰度值均未见明显变化。5、脑纹状体细胞凋亡用流式细胞仪检测发现,随着染锰剂量的增加,细胞凋亡率逐渐升高。各染锰组大鼠纹状体细胞凋亡率均明显高于对照组(P<0.01)。MK-801预处理组与200μmol/kg染锰组比较,细胞凋亡率明显下降(P<0.01)。通过电镜观察染锰组大鼠神经元细胞胞体缩小,核染色体固缩,边聚,出现空泡变性。二、体外神经元细胞培养1、神经元细胞活力和LDH释放量随锰浓度升高,细胞活力和LDH释放量均表现出明显的剂量-效应关系和时间-效应关系。根据MTT和LDH活力分析结果,我们将在后续试验中用25,100,400μmol/L锰处理浓度,作用神经元12h,这样不致于使细胞损伤过于严重,又能得到可靠的结果。2、TUNEL法检测细胞凋亡随锰浓度的升高,神经元细胞凋亡率和积分光密度均逐渐上升。用MK-801预处理30 min后,400μmol/L锰处理神经元发现,与单纯用400μmol/L锰处理比较,细胞凋亡率和积分光密度均有所下降(P<0.05)。3、神经元细胞NMDA受体mRNA和蛋白表达随着锰处理浓度的增加,NR1、NR2A, NR2BmRNA和蛋白的表达均有不同程度的下降,其中NR2A灰度值下降最明显。MK-801预处理组与400μmol/L锰处理组比较,NR1和NR2A的灰度值明显升高(P<0.05), NR2B灰度值均未见明显变化。4、神经元细胞内Ca2+浓度随着锰处理浓度的增加,细胞内钙离子浓度也逐渐升高。不同浓度锰处理组,细胞内钙离子浓度均明显高于对照组(P<0.05),MK-801预处理组与400μmol/L锰处理组比较,细胞内钙离子浓度明显降低(P<0.01)。5、神经元Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力随着锰处理浓度的增加,Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力逐渐下降。MK-801预处理组与400μmol/L锰处理组,Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力均明显升高。结论1、通过对大鼠腹腔注射氯化锰溶液成功建立了锰中毒大鼠模型。研究发现,锰可以在脑组织中聚积,损伤神经细胞,使大鼠产生神经毒性。2、通过体内动物实验发现,锰可破坏鼠脑纹状体内“Glu-Gln循环通路”,使Glu含量升高,此机制与锰干扰Glu代谢相关酶有关,锰可使PAG活力升高,GS活力下降。3、通过体内动物实验和体外神经元细胞培养发现,锰可以抑制NR1、NR2A和NR2B亚单位mRNA和蛋白的表达,并且NR2A亚单位对锰的抑制作用最敏感。4、利用体外神经元培养技术发现,锰对体外培养的神经元细胞具有明显的毒性作用。5、锰可以干扰体外培养神经元细胞内的钙稳态系统。6、由于MK-801能有效阻滞谷氨酸与突触后膜受体结合,既可以阻断NMDA受体偶联的Ca2+通道,又可以阻断L型ca2+通道,还有抗氧化作用,所以它可以通过多种机制对锰的神经毒性有一定的防护作用。