【摘 要】
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研究目的:研究组蛋白去甲基化酶在胚胎干细胞向心肌细胞分化中的作用及调控机制。内容:通过筛选、鉴定寻找与胚胎干细胞分化为心肌细胞相关的组蛋白去甲基化酶,揭示它们在胚
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研究目的:研究组蛋白去甲基化酶在胚胎干细胞向心肌细胞分化中的作用及调控机制。内容:通过筛选、鉴定寻找与胚胎干细胞分化为心肌细胞相关的组蛋白去甲基化酶,揭示它们在胚胎干细胞定向分化中的功能,并进一步探讨其分子机理。方法:本课题首先通过Q-PCR筛选出PHF8为调控心肌细胞分化的候选蛋白,并采用慢病毒感染对ES细胞进行基因操作;通过碱性磷酸酶染色、多能性标志蛋白表达分析鉴定KO细胞系的自我更新;通过MTT实验分析KO细胞系在未分化和分化过程中的细胞存活力;通过Brdu掺入法、细胞周期分析鉴定KO细胞系的增殖能力;通过早期凋亡标志蛋白annexin V染色、TUNEL法检测分析KO细胞的凋亡情况;通过早期胚层分化细胞标志基因和终末端细胞标志基因的表达分析鉴定KO细胞的三个胚层的分化能力。结果:通过对胚胎干细胞向心肌细胞分化中组蛋白去甲基化酶的表达谱筛选,我们发现PHF8表达在分化第1天骤然上升,之后随着分化时间推移逐渐下降,这提示我们PHF8可能在胚胎干细胞分化中具有重要的生物学功能。对PHF8敲除细胞系的研究发现,PHF8不调控ES细胞的自我更新,但PHF8的敲除抑制ES细胞向外胚层的分化,促进了向中胚层和内胚层分化,进而促进心肌细胞的分化。在对机制的研究中我们发现PHF8的敲除抑制分化中的胚胎干细胞的凋亡水平,尤其是早期中胚层前体细胞的凋亡。进一步凋亡机制的研究发现PHF8敲除虽然促进了经典凋亡蛋白caspase3总蛋白和活性片段的表达却并未促进凋亡,而是通过抑制凋亡诱导因子AIF(apoptosis induce factor)实现对ES细胞分化凋亡抑制。结论:PHF8的敲除不影响ES细胞自我更新,但抑制ES细胞向外胚层的分化,促进中胚层和内胚层分化,进而促进心肌细胞的分化。同时PHF8的敲除抑制分化中ES细胞的凋亡水平,尤其是早期中胚层前体细胞的凋亡。
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