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营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins,VIPs)是一类在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)营养期分泌的新型杀虫蛋白,对鳞翅目害虫具有较好的杀虫活性,Vip蛋白与任何已知的杀虫晶体蛋白没有同源性,其杀虫机理也与杀虫晶体蛋白不同。Vip蛋白不仅能够扩大Bt的杀虫谱,同时可以抑制或延缓农业害虫抗药性的产生,具有十分重要的应用前景,这也使得Vip蛋白引发了人们的日益关注。然而,Vip蛋白的三级结构目前尚未被解析,结构与功能之间的关系还未被人们所了解,并且存在杀虫活性有待进一步提高等问题,所以急需对该蛋白的结构功能进行研究,寻找杀虫活性关键氨基酸位点。本文运用定点突变的方法对Vip3Aa11杀虫活性关键氨基酸位点进行了探讨,并摸索建立了 Vip3Aa11随机突变的方法,筛选出活性改变的突变体,为改造Vip蛋白奠定了理论及实验基础。虽然Vip3Aa蛋白之间的序列差异性小于5%,但是,不同的Vip3Aa蛋白的杀虫谱和杀虫活性却存在很大差异。本研究中,首先通过对本实验室保存的Vip3Aa11与Vip3Aa39蛋白氨基酸序列比对,利用定点突变技术,成功构建了 Vip3Aa11的氨基端9个和羧基端19个定点突变蛋白,通过对初孵甜菜叶蛾(Spodoptera exigua)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫进行杀虫活性测定,在氨基端,获得对甜菜夜蛾(S.exigua)杀虫活性提高的突变体2个(S9N和S193T),杀虫活性提高2-3倍;获得对棉铃虫(H.armigera)杀虫活性提高的突变体3个(S9N、S193T、S194L),杀虫活性提高1.5-3倍。在羧基端,获得对甜菜夜蛾(S.exigua)杀虫活性提高的突变体3个(S726T、F760L和E761G),杀虫活性提高2.6-6倍;获得对棉铃虫(H.armigera)杀虫活性提高的突变体4个(N470K、D611N、N691H和I706N),杀虫活性提高1.5-3.8倍。R115H、I358V、I362M、K553I和I663T五个突变体对棉铃虫的杀虫活性出现明显的降低。SDS-PAGE分析显示,除V116I和T257A两个突变体外,所有突变体与野生型Vip3Aa11均能表达88kDa大小的蛋白条带,表达水平一致,经胰蛋白酶体外消化后均可形成一个稳定的62-66 kDa抗性核心多肽,酶解速度基本一致,由此推断突变子杀虫活性的变化并不是由于产生了不稳定的蛋白导致的。由于Vip3Aa蛋白结构尚未解析,突变体杀虫活性变化具体原因尚不清楚,还需进一步设计实验去分析、验证。Vip3Aa蛋白在野生型的Bt菌株中表达量不高,并且表达的蛋白也不稳定。有研究指出利用Bt Ⅰ-Bt Ⅱ启动子表达vip3Aa基因编码的蛋白,可以有效的提高Vip3Aa蛋白的稳定性及其蛋白表达量。本研究中利用基因重组技术,将cry1Ac的启动子与vip3Aa11基因重组,转化宿主菌,并且与T7启动子表达的Vip3Aa11蛋白在杀虫活性、胰蛋白酶稳定性方面进行初步探索,分析不同培养条件对表达量的影响,以期提高Vip3Aa蛋白的表达量、稳定性乃至提高其杀虫活性。结果显示cry1Ac启动子与T7启动子指导表达的Vip3Aa11蛋白对甜菜叶蛾(S.exigua)和棉铃虫(H.armigera)杀虫活性差异不显著,蛋白表达量较T7启动子指导表达的Vip3Aa11蛋白低,在抗胰蛋白酶稳定性方面较T7启动子指导表达的Vip3Aa11蛋白高。研究结果为vip基因的表达、功能验证及杀虫机理等研究提供了新的途径,同时也为后续的随机突变提供了新的材料。Vip3A蛋白的三维结构尚未被解析,通过前期研究发现Vip3Aa11的羟基端突变对其杀虫活性的影响较大。本研究对Vip3Aa11的羧基端随机突变进行了研究,利用荧光定量PCR监测PCR扩增过程,确定建立预期每个转化子突变1.5个碱基的突变率需要的易错PCR条件为:起始模板量为3.76 ng、PCR循环数为15个。经过一轮易错PCR,获得900个转化子,随机选取30个转化子测序分析显示,核苷酸发生改变的突变体有13个,总共20个碱基的点突变,平均每个转化子突变1.5个碱基,与预期相符。通过甜菜叶蛾(S.exigua)和棉铃虫(H.armigera)对13个突变体进行生物活性测定筛选,在2 μg/mL的浓度下,获得2个对甜菜夜蛾活性提高的突变体(A10、A21),在40 μg/mL的浓度下,获得3个对棉铃虫活性提高的突变体(A10、A20、A21),这一方法将为今后Vip蛋白的改造及结构与功能的研究奠定了良好的基础。