倭蛙(Nanorana pleskei)为青藏高原特有物种,是动物高原适应性研究的良好材料。本实验室前期研究表明,为了抵抗冬季的冷胁迫和结冰风险,倭蛙会在冬眠之前积累一定浓度的尿素作为抗冻保护剂。目前有关倭蛙代谢的季节性适应以及尿素积累机制的研究相对较少。本文以倭蛙为研究对象,通过测定不同季节不同温度(5、15、25℃)下的标准代谢率(SMR),主要代谢途径中关键代谢酶包括柠檬酸合酶(CS)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙酮酸激酶(PK)、β-羟酰基辅酶A脱氢酶(HOAD)、谷氨酸脱氢酶(GDH)的活性,探究倭蛙代谢的季节性适应策略;此外,我们还测定了不同组织中尿素和总氨含量、总蛋白含量、组织含水量、器官体重比、尿素循环关键调控酶氨甲酰磷酸合酶(CPS-1)和N-乙酰-L-谷氨酸合成酶(NAGS)的活性,以及尿素、氨排泄率的季节性变化,从生理生化层面揭示冬眠前尿素积累的机制。同时,通过低温驯化(4℃、黑暗、潮湿条件下1个月)研究了低温对夏季倭蛙代谢活动及尿素合成的影响。实验结果表明,倭蛙代谢率存在显著的季节性差异,并且受低温驯化的影响,春季代谢率极显著地高于其他季节,而在秋季时出现了代谢抑制现象。倭蛙肝脏中主要代谢酶活性也存在季节性变化,PK和LDH活性均是春季最高,表明倭蛙春季无氧糖酵解活动剧烈,可能和倭蛙的繁殖、出眠后的损伤修复以及春季短时间内剧烈活动的增加有关;而在秋季时PK活性显著降低,表明秋季时糖的氧化分解受到抑制。PK活性的调节对动物代谢的调控具有重要意义,其活性的季节性变化可能是造成代谢率季节性差异的主要原因。夏季和秋季HOAD活性显著地高于春季,表明倭蛙夏秋二季脂质代谢活跃;秋季GDH活性显著升高,表明倭蛙秋季氨基酸分解代谢旺盛。低温驯化使得CS活性显著升高,可能是一种低温补偿策略。我们推测酶活性的改变导致主要供能物质的转换,是倭蛙季节性适应的重要策略,秋季氨基酸分解代谢增强可为尿素循环提供充足的氮源,可能是尿素积累的一个重要原因。同时秋季肝脏和肌肉组织中总蛋白含量极显著高于夏季和春季,此时蛋白质可能既作为能源储备,也作为氮的储备发挥作用。CPS-1和NAGS活性测定结果显示,CPS-1活性的发挥强烈地依赖于N-乙酰-L-谷氨酸(NAG)的激活作用,不存在NAG时活性极低,并且酶活性不随温度的升高而升高。NAGS活性调控着CPS-1活性的发挥,NAGS活性的改变可能导致尿素生产能力的不同,秋季NAGS活性显著升高可能是尿素积累的重要原因。对夏季采集的倭蛙进行一个月的低温驯化后发现,NAGS活性显著升高,血浆、肝脏中尿素含量呈现出与NAGS活性相同的变化趋势,尿素的积累可能是倭蛙对低温刺激的一种响应。氨和尿素的排泄率也呈现季节性变化,秋季时氨和尿素排泄率均显著降低,表明尿素的重吸收作用在秋季时增强。值得注意的是,肾脏体重比也存在季节性差异,秋季显著高于夏季,低温驯化后倭蛙的肾脏体重比也显著增加,这一变化可能和尿素重吸收作用的增强相关,相关机制需要进一步验证。综上所述,倭蛙的代谢呈现季节性变化,可能是其适应高海拔环境的重要生理策略;秋季尿素生产能力的增加与尿素重吸收作用的增强共同作用,最终导致了冬眠前尿素积累,这可以看作是倭蛙主动适应环境的表现。低温驯化引起倭蛙尿素的积累,也从另外一个方面证实了尿素积累与低温有关。