近年以来，线粒体功能受损被认为与许多药物的毒副作用密切相关，线粒体损伤在药物毒性中的作用越来越受到人们的重视。线粒体是细胞内一个重要的细胞器，存在于各个脏器组织中，其中肝脏与肾脏中含量较为丰富。线粒体提供了细胞所需的绝大部分能量，同时还参与了多个代谢过程，因此线粒体易于成为药物毒性作用的靶点。目前一般认为药物通过六种不同的机制损伤线粒体：抑制电子传递链的作用，氧化磷酸化的解偶联作用，影响线粒体通透性，对线粒体脂肪酸代谢的抑制作用，使线粒体DNA损伤，抑制线粒体DNA的合成。本文作者从整体水平，细胞水平，亚细胞水平以及分子水平等不同的层次，系统的建立了以线粒体损伤为核心的肝脏肾脏毒性的检测体系，除了检测肝肾毒性血液生化，形态学改变等一般毒性指标外，本文作者建立了系统的线粒体损伤检测方法和指标，并利用该方法体系研究了马兜铃酸(aristolochic acid, AA)与汉防己甲素(tetrandrine，Tet)的毒性及其毒性机制。　　 本研究的第一部分：建立了系统的药物线粒体损伤检测体系。　　 第一，线粒体电子传递链活性检测：用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测线粒体电子传递链活性，并用生化学方法检测线粒体电子传递链复合物I-IV活性。　　 第二，线粒体氧化磷酸化活性检测：采用Clark-type氧电极检测线粒体stateIII与state IV呼吸速率，呼吸控制率(respiratory control ratio，RCR)，磷氧比(ADP/O ratio)。　　 第三，药物对线粒体脂肪酸代谢的影响：检测线粒体内丙二醛(malondiald-ehyde，MDA)水平指征线粒体内脂质过氧化水平，从而观察药物对线粒体脂肪代谢的影响。　　 第四，药物对线粒体通透性的影响：利用线粒体通透性改变(mitochondrialpermeability transition，MPT)的特异性抑制剂环胞菌素A(cyclosporine A，CsA)与米酵菌酸(bongkrekic acid，BA)在细胞和分离线粒体上检测药物对MPT的影响，同时检测细胞色素c(cytochrome c，cyto c)，细胞ATP含量，线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)等指标指征药物对线粒体通透性的影响。　　 第五，线粒体DNA损伤检测：利用根据特定位点设计的引物对线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)通过普通PCR，实时定量PCR，长链扩增PCR等方法检测组织或细胞内mtDNA的copy数量，缺失情况以及氧化损伤的情况。　　 本研究的第二部分：利用线粒体损伤检测体系研究并探讨了马兜铃酸的毒性及其毒性机制。马兜铃酸在许多中药材中广泛存在，含马兜铃酸的中草药肾毒性问题已引起国内外学者的广泛关注，但是马兜铃酸肾毒性的机制目前并不明确。在本文作者的实验中，首先在人来源的肾小管上皮细胞(human renal tubularepithelial cell，HK-2)中，发现线粒体通透性改变在马兜铃酸I细胞损伤作用中具有重要的作用。在此基础上，进一步研究了马兜铃酸I对分离肾脏线粒体的作用，探讨了马兜铃酸I对线粒体的作用及其可能的机制。　　 在HK-2细胞中，10-25μM的马兜铃酸I显著的降低了线粒体膜电位与细胞内ATP含量，并使细胞色素c释放，caspase3活性明显增加。这些马兜铃酸I的损伤作用均可以被线粒体通透性改变的特异性抑制剂环胞菌素A和米酵菌酸所抑制，说明线粒体通透性改变与马兜铃酸I诱导的肾小管上皮细胞损伤相关。本文作者进一步观察了马兜铃酸I对分离大鼠肾脏线粒体的作用。研究结果表明，10-25μM的马兜铃酸I均可以诱导线粒体肿胀，线粒体内钙释放，线粒体膜电位下降以及细胞色素c释放。这些作用也均可以被环胞菌素A所抑制。同时本文作者还发现马兜铃酸I可以显著的抑制与线粒体通透性改变密切相关的ADP/ATP转运酶(aderune nucleotide translocase，ANT)活性，本文作者推测这一抑制作用可能与马兜铃酸I诱导线粒体通透性改变的作用相关。另外实验发现马兜铃酸I对线粒体电子传递链，氧化磷酸化以及β氧化的活性均没有显著影响。综合上述结果可见，马兜铃酸I可以诱导经由线粒体途径的HK-2细胞损伤，线粒体通透性改变在其中起到重要的作用。　　 本研究的第三部分：研究并探讨了汉防己甲素的毒性及其毒性机制。汉防己甲素(tetrandrine，Tet)是从中草药粉防己(stephauatetrandran)根块中提取的双苄基异喹啉类生物碱，是粉防己的主要有效成分。汉防己甲素广泛应用于临床上多种疾病的治疗，但其潜在的肝毒性未能得到足够的重视。本研究首先从动物整体水平证明汉防己甲素可引发显著肝脏毒性。其次，在大鼠原代肝脏细胞(rat primary hepatocytes)中深入探讨了氧化应激(oxidative stress)，线粒体功能紊乱以及细胞色素P450(cytochrome P450s，CYP450)在汉防己甲素所致肝脏毒性中的作用。同时探讨了汉防己甲素对分离大鼠肝脏线粒体的作用。本研究为汉防己甲素的临床安全用药提供了可靠的实验依据。　　 SD大鼠口服汉防己甲素(33，57及100 mg/kg)8天，血清丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase，ALT)，天冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase，AST)显著升高。TUNEL染色法检测发现57mg/kg及100 mg/kg剂量组的大鼠肝脏细胞发生明显凋亡。汉防己甲素还使肝脏组织内谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量明显下降。在大鼠原代肝脏细胞中，10-25μM汉防己甲素可导致明显的细胞ATP含量与线粒体膜电位下降以及细胞色素c释放，同时激活caspase3。环胞菌素A能明显抑制汉防己甲素引起的caspase3的激活。同时，环胞菌素A也能抑制汉防己甲素引起的细胞ATP含量，线粒体膜电位下降和细胞色素c释放。10μM汉防己甲素处理后，细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平随时间延长而增加，GSH含量随时间延长而下降。本文作者使用各种细胞内ROS产生体系的抑制剂，发现只有CYP450的抑制剂可以抑制汉防己甲素诱导的ROS增加，CYP450的非特异性抑制剂SKF-525A(SKF)可以显著的抑制汉防己甲素引起的GSH耗竭。而CYP450抑制剂(非特异性抑制剂)可以明显的抑制汉防己甲素引起的细胞ATP含量、线粒体膜电位下降。CYP450抑制剂的作用强于抗氧化剂维生素c(vitamine c，Vc)，后者的作用则与环胞菌素A接近。综合上述结果可见，ROS在汉防己甲素诱导的线粒体通透性改变中起着重要的作用，而汉防己甲素诱导的ROS则来源于CYP450。另外本文作者还使用各CYP450特异性抑制剂，发现CYP2C6/2C11、CYP2D1/2D2以及CYP2E1的抑制剂可以抑制汉防己甲素引起的细胞ATP含量下降，其中CYP2D1/2D2的抑制剂奎宁(quinine，QUN)作用最显著，说明汉防己甲素肝细胞损伤作用可能与汉防己甲素与CYP2D1/2D2等CYP450酶的相互作用有关。　　 本文作者进一步观察了汉防己甲素对大鼠肝脏分离线粒体的作用。研究结果表明，不同浓度汉防己甲素均可以显著抑制高浓度钙离子诱导的线粒体肿胀，线粒体内钙离子的外流，线粒体膜电位的下降和ROS的产生。Western blot结果也表明，汉防己甲素抑制线粒体cyto c的释放。汉防己甲素可抑制高浓度钙离子诱导的线粒体内GSH的消耗，ADP/Fe2+诱导的MDA的增加，同时较高浓度的汉防己甲素(50-100μM)可诱导Mn-superoxide dismutase(Mn-SOD)的活性升高，而汉防己甲素处理后的线粒体内过氧化氢酶(catalase，CAT)活性也明显升高。此外，汉防己甲素能显著抑制苍术苷(atractyloside，AR)诱导的ANT活性的下降。上述结果表明，汉防己甲素能够显著抑制线粒体通透性的改变，对钙离子诱导的线粒体氧化损伤也有明显的抑制作用，具有较强的抗氧化能力。另外汉防己甲素只有在较高浓度(>200μM)的时候，才能对线粒体氧化磷酸化产生影响，而对线粒体电子传递链活性则没有明显影响。　　 结合汉防己甲素体内，体外原代肝脏细胞以及分离肝脏线粒体的结果可见，汉防己甲素在体内，体外肝脏细胞中可以诱发氧化损伤与线粒体通透性改变，而在分离的大鼠肝脏线粒体中，则具有显著的抗氧化能力，并抑制高浓度钙离子诱导的线粒体通透性改变，这一相悖的结论可能和汉防己甲素与CYP2D1/2D2等CYP450酶的相互作用有关。