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背景:急性胰腺炎（acute pancreastitis,AP）是一种胰酶消化自身胰腺以及周围组织的急性炎症性疾病,其重症坏死性胰腺炎病死率高,发病机制至今仍不清楚,随着胰蛋白酶原的异常激活作为急性胰腺炎发病机制起始阶段理论假说的深入研究,发现自噬调节参与其中。作为维持细胞稳态的重要环节之一,研究发现自噬在AP中可以选择性吞噬胰蛋白酶保护胰腺,也可因为自噬自身障碍引发AP。丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型（serine protease inhibitor Kazal type 1,SPINK1）作为胰蛋白酶抑制剂,保护胰腺组织并维持细胞完整和促进再生。研究发现SPINK1基因敲除的小鼠胰腺组织出现大量自噬空泡,提示SPINK1可负性调节小鼠胰腺腺泡的自噬水平,也有报道SPINK1过表达小鼠AP中,胰酶活性和组织损伤明显减轻,尽管机制未阐明。那么SPINK1作为自噬的负调节因子在AP中对胰酶原发挥了怎样的作用,其在AP中的作用机制如何?还有待人们进一步研究。目的:探索SPINK1在体外AP模型中对胰酶原的作用,进一步阐述AP的发病机制。方法:1.观察体外AP模型中自噬与细胞表型的变化,利用雨蛙素（雨蛙肽）建立体外AP模型,Western blot和m RFP-GFP-LC3双荧光自噬指示体系的方法观察体外AP模型中自噬及自噬通量的变化,以及CCK8实验研究体外AP模型细胞表型的变化。2.研究SPINK1（过表达、沉默）对AR42J细胞自噬及细胞表型的影响。构建大鼠过表达SPINK1和大鼠沉默SPINK1慢病毒载体,用慢病毒包装、感染的方法构建稳定过表达SPINK1-AR42J和稳定沉默si SPINK1-AR42J细胞株,利用Western blot研究SPINK1对AR42J细胞自噬及自噬通量的影响,通过CCK8、平板细胞克隆形成实验研究SPINK1对AR42J细胞表型的影响。3.研究SPINK1（过表达、沉默）在体外AP模型中对胰酶活性、自噬和细胞表型的影响,分别利用酶标仪、Western blot和m RFP-GFP-LC3双荧光自噬指示体系、CCK8的方法检测AR42J、过表达SPINK1-AR42J及沉默si SPINK1-AR42J细胞株体外AP模型的胰酶活性、LC3B、P62、Atg5的蛋白含量和增殖能力。4.利用自噬抑制剂CQ与3-MA进一步探索自噬与体外AP模型胰酶活性的关系。结果:1.体外AP模型建立成功,与对照相比其自噬相关蛋白Atg5、LC3B、P62增加,m RFP-GFP-LC3双荧光自噬指示体系实验中自噬体数量增多,自噬溶酶体数量减少,细胞活性明显增大;2.成功构建大鼠过表达PLent-EF1a-SPINK3-FH-CMV-GFP-P2A-Puro和大鼠沉默Pi Lenti-si RNA-GFP两个慢病毒载体;3.成功构建稳定过表达大鼠SPINK1-AR42J细胞株和大鼠si SPINK1-c AR42J沉默细胞株,可以稳定高表达SPINK1和稳定沉默SPINK1;4.检测AR42J、过表达SPINK1-AR42J、沉默si SPINK1-AR42J三株细胞的增殖及克隆形成能力发现与对照相比过表达SPINK1的正常细胞株细胞活性增大,增殖能力及克隆形成能力均增强,而沉默则相反,P＜0.005;5.SPINK1对正常AR42J细胞自噬的影响结果为Western blot检测过表达SPINK1-AR42J细胞株与对照组相比LC3B和P62蛋白含量明显降低;6.在体外AP模型中,与对照组相比,过表达SPINK1AR42J细胞株的活细胞及死细胞胰酶活性均明显降低,P＜0.005,而沉默SPINK1AR42J细胞株的活细胞及死细胞胰酶活性均明显增高,P＜0.005;过表达SPINK1AR42J细胞组中的LC3B、Atg5的蛋白含量显著降低,P62蛋白含量明显增高;m RFP-GFP-LC3双荧光自噬指示体系实验中过表达SPINK1AR42J细胞组中的自噬溶酶体的数量增加,自噬体的数量减少,P＜0.005,沉默SPINK1AR42J细胞组中的自噬溶酶体的数量显著下降,自噬体的数量明显上升,P＜0.005;7.CCK8实验中过表达SPINK1AR42J细胞组OD值无明显变化,P＜0.05,沉默SPINK1AR42J细胞组OD值明显降低,P＜0.001;8.CQ与3-MA预处理的体外AP模型的胰酶活性明显降低,并且3-MA预处理的体外AP模型的胰酶活性明显低于CQ预处理的胰酶活性。结论:本研究证实了体外AP模型中自噬增强,自噬流不通畅,自噬受阻的事实;SPINK1不仅参与调节细胞生理基础自噬流并促进自噬流通畅,过表达之后还能减轻体外AP模型中受损的自噬而使自噬流通畅;另外过表达SPINK1和抑制自噬均能降低体外AP模型的胰酶活性,而且沉默SPINK1可抑制AP胰酶活性。综上所述在体外AP中,SPINK1通过改善受损自噬参与抑制胰酶原的异常激活。