醌那霉素是由II型聚酮合酶系统产生的一类角蒽环类聚酮化合物。从结构上看,其具有三个显著的特征:苯并芴核,高度氧化的A环,以及芴环上的重氮基团,据报道这三个官能团都与其生物活性相关。因此许多关于醌那霉素生物合成的研究都是围绕上述三个官能团的形成展开的。醌那霉素因其特殊的苯并芴结构因而具有良好的生物活性,所以引起了广泛的研究兴趣。苯并芴结构形成的关键在于芴环的形成。前期研究表明,在醌那霉素的生物合成途径中是由Alp J和Alp K协同作用来负责原芳香环的开环与闭环,从而形成芴环结构。在前期研究推测的作用机制中,Alp J利用Alp K提供的FADH2将芳香环氧化开环与脱羧闭环。Alp K一方面为Alp J提供所需要的FADH2,另一方面将形成的苯并芴中间体进行羟化,防止中间体发生聚集从而流出醌那霉素生物合成代谢途径。本研究利用体外重建的酶催化反应体系对Alp J和Alp K协同作用方式进行了研究。实验结果表明Alp J不需要Alp K为其提供FADH2也能催化开环和闭环反应的发生。在没有Alp K存在的情况下,Alp J则可能完成苯并芴中间体的羟化。本研究首次发现Alp J在不需要辅因子的情况下可以与底物发生反应生成两个反应产物。通过对其中一个反应产物结构的鉴定,证明Alp J不需要辅因子可以将芳香环打开。由于另一反应产物极不稳定,未能完成对其结构的鉴定,但是诸多实验线索皆暗示Alp J不需要辅因子也能完成后续闭环反应。迄今为止醌那霉素的生物合成途径并没有得到完全的解析,尤其是对重氮基团的形成依然所知寥寥。前期研究因缺少醌那霉素完整的生物合成基因簇信息而受到阻碍。本课题组最近确证了醌那霉素的完整生物合成基因簇,共包含62个基因,其中有8个基因并没有被报道过。通过生物信息学分析,我们发现其中alp2F和alp2G基因与cremeomycin生物合成中的cre E和cre D具有高度的同源性。cre E和cre D基因产物通过催化天冬氨酸生成亚硝酸,其后亚硝酸在酸性条件下自发加载到化合物的碳骨架上,实现重氮基团的加载。本研究通过体外酶催化反应证实了Alp2F和Alp2G同样可以催化天冬氨酸生成亚硝酸。亚硝酸钠喂养实验进一步确证了亚硝酸盐参与醌那霉素的合成。alp2F和alp2G基因功能体外和体内的确证,不仅是对醌那霉素生物合成基因簇中未知基因功能的表征,也对阐明醌那霉素家族天然产物中重氮基团的形成有启发意义。