【摘 要】
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背景:慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）是一种以肾脏结构、功能或两者出现持续性异常为特征的临床综合征,目前已对全球人类健康构成了重大威胁。肾纤维化是CKD进程中的最后结局,上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）是引起肾纤维化的关键机制,而基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）
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背景:慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）是一种以肾脏结构、功能或两者出现持续性异常为特征的临床综合征,目前已对全球人类健康构成了重大威胁。肾纤维化是CKD进程中的最后结局,上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）是引起肾纤维化的关键机制,而基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）可诱导肾小管上皮细胞EMT过程以促进肾纤维化的发生。利水渗湿中药茯苓皮为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥外皮,其主要化学成分为四环三萜类化合物,具有抗肾纤维化作用。本研究揭示茯苓酸ZI通过抑制基质金属蛋白酶-13改善EMT抗肾纤维化的机制。目的:探讨茯苓皮中四个新化合物茯苓酸ZI（Poricoic acid ZI,PZI）、茯苓酸ZJ（Poricoic acid ZJ,PZJ）、茯苓酸ZK（Poricoic acid ZK,PZK）和茯苓酸ZL（Poricoic acid ZL,PZL）通过抑制MMP-7、MMP-9、MMP-13的表达调控EMT改善肾纤维化的作用及其机制,为利水渗湿中药茯苓皮的合理应用及其抗肾纤维化研究提供参考理论和科学依据。方法:1.以茯苓皮乙酸乙酯部位提取分离的四环三萜类化合物为研究对象,采用分子对接模拟方法对其与MMP-7、MMP-9、MMP-13进行相互作用分析,初步筛选茯苓皮中抗肾纤维化的活性成分。2.建立TGF-β1诱导的HK-2、NRK-52E、NRK-49F细胞模型,采用Western blotting分析、细胞免疫荧光染色分析、si RNA干扰和MMP-13活性测定等方法研究PZI、PZJ、PZK、PZL对MMP-7、MMP-9、MMP-13及EMT相关蛋白表达的影响,探讨四个新茯苓酸抗肾纤维化的作用及其机制。3.建立单侧输尿管梗阻（Unilateral ureteral obstruction,UUO）小鼠模型,通过HE染色、Masson’s trichrome染色和免疫组织化学染色等病理组织染色方法,观察PZI对UUO小鼠肾纤维化的改善作用。采用Western blotting分析、MMP-13活性测定及MMP-13 sh RNA等方法进一步研究PZI对MMP-13的选择性抑制作用及对EMT相关蛋白表达的影响。结果:1.分子对接结果证明已知化合物PG、PZD能够与MMP-7、MMP-9、MMP-13的活性位点结合,新化合物PZI、PZJ、PZK、PZL能够与MMP-9、MMP-13的活性位点结合,其中四个新茯苓酸与MMP-13具有更好的亲和性。2.在TGF-β1诱导的HK-2、NRK-52E和NRK-49F细胞模型中,PZI、PZJ、PZK、PZL处理后均能显著下调MMP-7、MMP-9、MMP-13的表达和下调CollagenⅠ、CollagenⅢ、Fibronectin、α-SMA、Vimentin及上调E-Cadherin等EMT相关蛋白的表达,其中PZI对MMP-13及EMT相关蛋白的抑制作用最强。MMP-13 si RNA细胞转染实验中,PZI的抑制作用被部分减弱,表明PZI可通过选择性抑制MMP-13的表达调节EMT过程从而改善肾纤维化。3.在UUO小鼠模型中,PZI给药后能显著减轻小鼠肾组织纤维化病理改变并选择性抑制MMP-13及EMT相关蛋白的表达,与体外细胞结果一致。结论:本研究表明PZI、PZJ、PZK、PZL四个新茯苓酸可通过抑制MMP-7、MMP-9、MMP-13的表达调控EMT过程从而改善肾纤维化,进一步揭示了PZI对MMP-13的选择性抑制作用,是治疗肾纤维化的潜在药物。
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