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第一部分外周血O-GlcNAc糖基化和tau蛋白磷酸化水平与2型糖尿病轻度认知功能障碍的相关性研究背景:O-GlcNAc糖基化修饰是一种常见的翻译后修饰,其底物来源于葡萄糖代谢中的己糖胺生物合成途径。既往研究认为,异常的O位N-乙酰葡萄糖胺(O-linked N-acetylglucosamine,O-GlcNAc)糖基化修饰与2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的发生密切相关,又可通过与tau蛋白磷酸化竞争性结合蛋白质的丝氨酸(serine,Ser)或苏氨酸(threonine,Thr)位点从而参与神经退行性疾病的发生发展。因此,O-GlcNAc糖基化修饰可能在糖尿病认知功能障碍(diabetes-associated cognitive dysfunction,DACD)的发生发展中起重要作用。目的:探讨T2DM受试者外周血O-GlcNAc糖基化、tau蛋白磷酸化水平与轻度认知功能障碍(mild cognitive impairment,MCI)的相关性。方法:本研究采用病例-对照设计方法,共纳入T2DM受试者48例。根据蒙特利尔认知评估量表(Montreal Cognitive Assessment,MoCA)测评得分,将受试者分为MCI组24例及认知功能正常组(Con组)24例,收集其社会人口学资料、临床资料及多维度神经病学量表测评得分,并用Western blot测定外周血O-GlcNAc糖基化及tau蛋白磷酸化水平。结果:1、与Con组相比,MCI组的空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)和糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin,HbA1c)水平显著升高,空腹C肽(fasting C-peptide,FCP)和血尿酸(serum uric acid,SUA)水平显著降低(p<0.05),且总的认知得分及各认知领域得分均显著降低(p<0.05)。2、与Con组相比,MCI组的O-GlcNAc糖基化水平显著降低,而总的tau蛋白及Ser396、Ser404、Thr212、Thr231位点磷酸化的tau蛋白水平均显著升高(p<0.05)。为反映二者的综合效应,我们对其进行了比值分析,MCI组的O-GlcNAc/Tau-5、O-GlcNAc/p-S396、O-GlcNAc/p-S404、O-GlcNAc/p-T212及O-GlcNAc/p-T231均较Con组显著降低(p<0.05)。3、二元Logistic回归分析显示,HbA1c水平是T2DM患者发生MCI的独立危险因素,O-GlcNAc/p-T212是T2DM发生MCI的独立保护因素(OR=2.452,95%CI 1.061-5.668,p=0.036;OR=0.028,95%CI 0.002-0.388,p=0.008)。4、偏相关分析结果显示,在控制了FBG和HbA1c水平后,O-GlcNAc/p-T212与听觉词语学习测试的延迟回忆得分呈正相关(r=0.377,p=0.010)。结论:O-GlcNAc/p-T212比值降低与T2DM轻度认知功能障碍、尤其与记忆功能障碍有关。第二部分O-Glc NAc糖基化和tau蛋白磷酸化在2型糖尿病认知功能障碍中的作用及格列美脲的干预研究背景:慢性高血糖是T2DM最主要的临床表现,也是DACD的独立危险因素之一。我们前期研究显示,DACD患者外周血存在O-Glc NAc糖基化和tau蛋白磷酸化水平的失衡,但是其脑内情况仍不清楚,选择有效手段防止其失衡可能为DACD提供新的治疗靶点。目的:观察T2DM认知障碍小鼠模型脑内O-Glc NAc糖基化和tau蛋白磷酸化水平,并予格列美脲干预,旨在观察降糖干预是否可以改善糖尿病小鼠的认知功能以及O-Glc NAc糖基化、tau蛋白磷酸化在其中的可能作用。方法:予KK-Ay小鼠专用饲料喂养,构建T2DM认知障碍的动物模型,C57BL/6小鼠作为对照,部分小鼠于16周龄时处死,部分小鼠进行格列美脲(低剂量:1mg/(kg·d);高剂量:2mg/(kg·d))灌胃,对照组予等体积溶媒灌胃,12周后处死。Morris水迷宫实验和被动回避实验检测小鼠的学习记忆功能;HE染色和尼氏染色检测小鼠脑组织的形态学改变;免疫荧光染色检测小鼠海马组织O-Glc NAc糖基化的定位情况、及其与tau蛋白磷酸化的表达情况;Western blot检测小鼠海马组织O-Glc NAc糖基化和tau蛋白磷酸化水平。结果:1、16周龄KK-Ay小鼠和C57BL/6小鼠的体质量、空腹血糖、空腹胰岛素水平均存在显著的统计学差异;格列美脲干预后空腹血糖水平显著下降,且呈剂量依赖性。2、Morris水迷宫实验和被动回避实验结果显示,16周龄KK-Ay小鼠较C57BL/6小鼠相比寻找平台潜伏期、寻找平台路径长度显著延长,目标象限停留时间百分比、穿梭平台次数显著减少;避暗潜伏期显著缩短,错误次数显著增加。格列美脲干预后KK-Ay小鼠的寻找平台潜伏期、寻找平台路径长度均显著缩短,目标象限停留时间百分比、穿梭平台次数均显著增加;避暗潜伏期显著延长,错误次数显著减少。3、HE染色和尼氏染色结果显示,16周龄KK-Ay小鼠海马组织部分细胞出现排列松散、结构破坏,胞浆内尼氏小体减少,尤以CA3区最为明显;格列美脲干预后KK-Ay小鼠海马CA3区细胞排列松散、结构破坏的现象有所改善,且尼氏小体数目增加。4、免疫荧光染色结果显示,O-Glc NAc糖基化修饰主要发生在海马神经元细胞,16周龄KK-Ay小鼠海马CA3区O-Glc NAc糖基化修饰的神经元数目减少,O-Glc NAc糖基化修饰降低,tau蛋白磷酸化升高;格列美脲干预后O-Glc NAc糖基化修饰的神经元细胞数目增多,O-Glc NAc糖基化水平升高,tau蛋白磷酸化水平降低。5、Western blot结果显示,16周龄KK-Ay小鼠较C57BL/6小鼠相比,海马组织O-Glc NAc糖基化水平降低,总的tau蛋白水平无显著差异,Ser396、Ser404、Thr212、Thr231位点磷酸化的tau蛋白水平显著升高;且关键酶OGT水平降低,OGA水平升高。格列美脲干预后O-Glc NAc糖基化水平升高,Ser396、Thr212位点磷酸化的tau蛋白水平降低,且伴随OGT水平升高。结论:T2DM小鼠的学习记忆功能下降可能与慢性高血糖引起的脑内O-Glc NAc糖基化和tau蛋白磷酸化水平失衡有关,改善葡萄糖毒性可能通过调节O-Glc NAc糖基化和tau蛋白磷酸化水平,从而改善糖尿病小鼠的学习记忆功能。第三部分高糖毒性诱导HT22细胞损伤的机制研究背景:Tau蛋白假说是DACD最主要的发病假说之一。前期实验结果证实:T2DM认知障碍小鼠海马组织存在O-Glc NAc糖基化和tau蛋白磷酸化水平的失衡;予降糖干预后,O-Glc NAc糖基化和tau蛋白磷酸化水平部分逆转,学习记忆功能损害有所缓解。但降糖干预改善DACD的机制尚未明确。目的:探讨高糖毒性诱导小鼠海马神经元细胞(HT22细胞系)损伤的机制。方法:采用HT22细胞作为细胞模型,高糖和AGEs干预作为高糖毒性模型,CCK8试剂盒检测不同葡萄糖或AGEs干预浓度和干预时间对HT22细胞活力的影响,予OGT质粒转染和格列美脲干预,实时荧光定量PCR检测OGT的m RNA表达水平,Western blot检测O-Glc NAc糖基化、tau蛋白磷酸化及OGT的蛋白表达水平。结果:1、高糖干预可使HT22细胞活力下降,且呈浓度和时间依赖性,本研究选取75m M的葡萄糖干预HT22细胞48h作为高糖毒性模型。2、与对照组相比,高糖干预组O-Glc NAc糖基化水平升高,Ser396、Ser404、Thr212、Thr231位点磷酸化的tau蛋白水平升高,同时伴随关键酶OGT m RNA和蛋白表达水平下降。3、AGEs干预可使HT22细胞活力下降,且呈浓度和时间依赖性,本研究选取400μg/m L的AGEs干预HT22细胞48h作为高糖毒性模型。4、与对照组相比,AGEs干预组O-Glc NAc糖基化水平降低、Ser396、Ser404、Thr212、Thr231位点磷酸化的tau蛋白水平升高,同时伴随关键酶OGT m RNA和蛋白表达水平下降。5、OGT质粒转染可逆转AGEs诱导的O-Glc NAc糖基化水平降低及Ser396、Ser404、Thr212、Thr231位点磷酸化的tau蛋白水平升高。6、格列美脲干预后OGT m RNA和蛋白表达水平升高,O-Glc NAc糖基化水平升高,Thr212位点磷酸化的tau蛋白水平降低;OSMI-1抑制OGT m RNA和蛋白表达后,格列美脲升高O-Glc NAc糖基化、降低tau蛋白磷酸化水平的作用部分被拮抗。结论:高糖毒性可通过下调OGT表达,引起O-Glc NAc糖基化水平降低,tau蛋白磷酸化水平升高,从而介导2型糖尿病相关的认知功能障碍。格列美脲在改善葡萄糖毒性的同时,尚可直接通过上调OGT水平,促进O-Glc NAc糖基化修饰,降低tau蛋白磷酸化水平,从而发挥神经保护作用。