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背景:最近的流行病学研究显示,糖尿病（Diabetes mellitus,DM）在中国18岁以上人群中的发病率目前已高达12.8%。糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）是糖尿病的主要并发症之一,也是导致终末期肾脏病（End stage renal disease,ESRD）的主要原因。DN以肾小球硬化性改变、足细胞数目减少、系膜基质异常增多、肾小管萎缩等一系列改变为特点。目前,越来越多的研究认为DN中肾小管上皮细胞损伤可独立于甚至早于肾小球损伤。因此,进一步探索肾小管上皮细胞在DN进展中的作用对于DN的防治仍具有不可忽视的意义。细胞焦亡是一种新近发现的炎性程序性细胞死亡（Programmed cell death,PCD）,被证明可发生于肾脏固有细胞之中并参与DN的进展。同时,细胞焦亡的过度发生一定程度上可以导致DN肾小管上皮细胞结构损伤加重。当细胞焦亡发生时,细胞膜破裂导致大量细胞内容物如IL-1β、IL-18等物质流出。糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可诱导众多信号蛋白磷酸化并参与不同疾病的发生发展。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是缺氧诱导因子-1的活性亚单位,可调控多种下游靶基因进而调节细胞代谢功能。近年来有多项研究表明GSK-3β可以通过磷酸化作用调节HIF-1α的表达。分别调控GSK-3β或是HIF-1α的蛋白表达水平都可影响细胞焦亡相关蛋白质的表达。此外,有研究表明氯化锂（Lithium chloride,LiCl）作为一种常见的GSK-3β活性抑制剂,可抑制caspase-1的表达并发挥抗焦亡及抗炎作用。然而,调节GSK-3β水平是否可影响肾小管上皮细胞焦亡的发生以及HIF-1α是否参与了该过程尚不清楚。综上所述,在高糖状态下肾小管上皮细胞会发生结构与功能的变化,肾脏细胞焦亡增加进而导致肾脏损伤。而作为与糖尿病肾病肾脏损伤有关的关键蛋白之一,GSK-3β很可能在肾小管上皮细胞焦亡中扮演重要角色。由于HIF-1α的功能多样性及其与细胞焦亡的关系,不排除HIF-1α参与了 GSK-3β调控细胞焦亡过程的可能性。本研究拟采用体外实验的方法来证明我们提出的GSK-3β/HIF-1α参与了高糖刺激时肾小管上皮细胞焦亡过程这一假设,为糖尿病肾病发病机制提供新的视角。方法:该研究在体外培养TKPT（Tissue kidney proximal tubule）细胞（一种小鼠近端肾小管上皮细胞）。1.高浓度葡萄糖（HG）刺激TKPT细胞模拟糖尿病高血糖状态:体外培养生长状态良好的TKPT细胞,以合适浓度接种于25cm2培养瓶或6孔板中,待细胞融合度达60%-70%后设为t=0。使用高葡萄糖浓度（30mM）DMEM培养基刺激TKPT细胞48小时。设置甘露醇组（Mannitol组,30mM）作为对照。2.应用慢病毒转染技术,建立TKPT-GSK-3β shRNA组以敲低GSK-3β表达。CON250阴性对照病毒转染TKPT细胞作为对照组（shNC组）。3.给予TKPT细胞不同浓度的LiCl（10mM、20mM、30mM）处理24h或用20mM的LiCl处理不同时间（12h,24h,48h）,以抑制GSK-3β活性,并同时在高糖（High glucose,HG,30mM）条件下培养48h。4.利用YC-1（利非西呱）和DMOG（二甲基乙二酰氨基乙酸,一种HIF-1α脯氨酰羟化酶抑制剂）分别抑制或促进HIF-1α表达,建立HG+GSK-3β-shRNA+DMOG 组和 HG+YC-1 组。5.检测GSK-3β表达变化:采用Western blotting检测各组细胞p-GSK-3β、GSK-3β蛋白表达水平。6.检测HIF-1α表达变化:采用Western blotting和细胞免疫荧光法检测各组细胞HIF-1α蛋白表达水平。7.检测细胞损伤情况:采用流式细胞术检测各组细胞焦亡水平。8.检测细胞焦亡相关指标:采用Western blotting检测各组细胞NLRP3、GSDMD、GSDMD-N、pro-caspase-1、cleaved-caspase-1 表达水平;采用细胞免疫荧光检测各组细胞GSDMD表达;采用ELISA检测试剂盒检测各组细胞培养上清中cleaved-IL-1β和IL-18的水平。结果:1.高糖刺激TKPT细胞48h后,p-GSK-3β（S9）表达水平减少（活性增加）而HIF-1α表达水平升高;细胞焦亡标志蛋白NLRP3、GSDMD、GSDMD-N、cleaved-caspase-1、IL-1β、IL-18等表达水平升高,细胞凋亡率升高,同时这种作用与高渗状态无关。2.慢病毒转染TKPT细胞抑制GSK-3β表达后,高糖刺激48h,NLRP3、caspase-1等焦亡相关蛋白表达水平及HIF-1α表达水平均逐渐降低,细胞凋亡率下降。3.高糖状态下,随着LiCl浓度的升高或刺激时间的延长,p-GSK-3β表达水平逐渐增高,表明GSK-3β活性逐渐降低。同时,随着GSK-3β活性逐渐降低,NLRP3、caspase-1等焦亡相关蛋白表达水平及HIF-1α表达水平均逐渐降低,细胞凋亡率下降。4.高糖条件下使用HIF-1α抑制剂YC-1刺激TKPT细胞24h后,HIF-1α表达降低,p-GSK-3β表达未有明显改变,而NLRP3、caspase-1等焦亡相关蛋白表达水平下降,细胞凋亡率下降。5.慢病毒转染TKPT细胞抑制GSK-3β表达后,高糖条件下使用HIF-lα稳定剂DMOG刺激TKPT细胞24h,HIF-1α表达升高,p-GSK-3β表达未有明显改变,而NLRP3、caspase-1等焦亡相关蛋白表达水平升高,细胞焦亡水平降低的情况被逆转,细胞凋亡率升高。结论:高糖条件下GSK-3β可通过调控HIF-1α诱导肾小管上皮细胞焦亡