丛枝菌根(AM)真菌是一种土传真菌,属于古老的球囊菌门,是丛枝菌根的重要共生体,增强植物养分的获取和对各种非生物逆境的抗性的重要来源。与其显著的生理意义相反,所涉及的分子基础尚不清楚,主要是由于它们的专性生物营养和复杂的遗传学。14-3-3蛋白是一种高度保守的蛋白质家族,它广泛存在于真核细胞中,14-3-3的同源或异源二聚体可以通过与其它蛋白质相互作用参与真核生物的信号传导和代谢活性。本实验以摩西球囊霉(Funneliformis mosseae)的Fm201 EST Tag为起点,分别从摩西球囊霉(Funneliformis mosseae)和根内球囊霉(Rhizophagus irregularis)中分离和鉴定了三个编码丛枝菌根真菌14-3-3 like蛋白的编码基因,并分别命名为Fm201,Ri14-3-3和Ri BMH2。通过荧光定量分析,发现Fm201,Ri14-3-3和Ri RMH2的表达量在前共生(孢子萌发)和共生阶段(附着胞形成,根内菌丝形成,丛枝形成时期)中都出现了明显的激增。因为缺乏有效的丛枝菌根真菌转化系统,为了Fm201,Ri14-3-3和Ri BMH2基因编码的功能,引入了酵母异源验证系统。酿酒酵母的14-3-3的双突变(bmh1,bmh2)是致死的,本实验通过在突变酵母BMH2时引入一个半乳糖诱导的Gal7启动子启动的丛枝菌根真菌14-3-3基因。数据表明,所有三个14-3-3 like基因编码蛋白在半乳糖培养基中均可以恢复酿酒酵母bmh1,bmh2致死双突变的正常代谢表型。此外,本实验在对Fm201基因进行3’RACE和5’RACE时,分别在它的5’UTR和3’UTR中各发现了一个内含子(或称为选择性剪接外显子)。5’UTR的内含子被认为参与了基因转录的增强,而3’UTR内含子的出现时由加尾信号的选择性识别引起的,这些被认为是高真核生物的基因调控机制。在对菌根共生过程中的Fm201L(含有长的3’UTR)和Fm201S(含有短的3’UTR))进行荧光定量分析是,且长短不同的Fm201在共生的不同时期出现了不同比例的波动。为了揭示这两种选择性剪切的内含子在14-3-3转录和翻译过程中的作用。分别以YGPF为报告基因,以酵母BY4741为宿主分别检测了5’UTR的转录活性和3’UTR在转录和翻译水平上的稳定性。结果表明,Fm201的UTRs可能对稳定RNA或增强转录具有重要意义。在对这三个14-3-3蛋白进行启动子分析(ATG上游1.5Kb序列)时,在酵母启动子相似的位置上发现了多个与非生物胁迫相关的STRE(CCCCT/AGGGG)顺式作用元件。重要的是,酵母单杂交分析表明,丛枝菌根真菌转录因子Ri Msn2(酵母中STRE顺式作用元件识别因子Msn2的同源蛋白)能够识别存在于Fm201基因启动子区的STRE元件。不仅如此,在酵母中当对Fm201的STRE元件进行点突变时,报告基因在非生物胁迫反映下的表达量出现了明显的下降。为了探索14-3-3蛋白在菌根共生关系维持过程中的作用,引入了宿主介导的基因沉默(Host Induced Gene Silence)。当对根内球囊霉-蒺藜苜蓿共生体中的丛枝菌根真菌Ri14-3-3和Ri BMH2基因进行沉默时时,共生体中的丛枝出现了早衰(或称为提前降解)的现象。不仅如此,苜蓿一侧与菌根丛枝形成相关的Mt PT4和Mt MST2基因的表达也出现了明显的下调。这些现象均说明了丛枝菌根真菌14-3-3蛋白在共生关系的维持过程具有十分重要的意义。进一步将丛枝菌根真菌和苜蓿蒺藜的菌根共生系统进行干旱或盐分胁迫等非生物胁迫,并收集材料进行荧光定量分析。非生物胁迫处理下的菌根(主要包括跟内菌丝和丛枝)和外生菌丝中的表达谱表明,这三个14-3-3基因均分别参与了干旱或盐分胁迫的响应。这一结果可能也与这三个基因启动子上的STRE顺式作用元件密切相关总的来说,上述实验结果为丛枝菌根真菌14-3-3蛋白在AM共生过程中非生物胁迫反应和菌根共生关系建立和维持过程中的分子功能提供了新的见解。