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目的:
舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)是目前最常见的口腔颌面部恶性肿瘤,约占80%以上。目前舌鳞癌的治疗,是以手术治疗为主,辅以化学药物治疗的综合疗法,其五年的生存率低于10%。由于舌鳞癌解剖部位的特殊性,手术治疗会造成患者头面部外貌的损伤,导致患者的发音、吞咽、进食等功能的障碍,使病患的心理及日常生活受到很大的影响。传统化学药物治疗的毒副作用大,且价格昂贵,因而寻找治疗效果良好、毒副作用小且价格合理的抗肿瘤药物,成为目前舌鳞癌临床治疗的热点。
片仔癀(Pien Tze Huang,PZH)是中国著名的传统名贵中成药,由三七、麝香、牛黄、蛇胆等构成,具有清热解毒、消肿止痛、活血化瘀等功效。片仔癀是一种有效的抗肿瘤药物,实验研究表明片仔癀对肝癌、结肠癌、骨肉瘤、胃癌及宫颈癌等恶性肿瘤的增殖有一定的抑制作用。目前还未见关于片仔癀对舌鳞癌的相关作用的报道。
多西他赛(docetaxel,DOC)是广谱抗癌药物,是以微管蛋白为靶点,使细胞周期于G2/M期发生阻滞,以致有丝分裂受阻,从而诱导细胞凋亡或死亡。多西他赛对头颈部癌、乳腺癌、肺癌、胃癌等恶性肿瘤皆有良好的治疗效果。临床应用多西他赛往往引起一系列较严重的不良反应。因此,寻找一种低毒性抗癌药物与多西他赛联合应用,既能减少多西他赛的用药剂量而发挥协同抗癌作用,又能降低该药物的毒副作用。
本实验旨在探讨片仔癀单独或联合多西他赛对舌鳞癌细胞Tca8113细胞生长、凋亡、细胞周期等方面的影响,并进一步研究其作用机理。
方法:
1、MTT法检测片仔癀单独或与多西他赛联合应用后,对舌鳞癌Tca8113细胞的增殖抑制作用。
2、用倒置显微镜观察片仔癀单独或与多西他赛联合应用后,对舌鳞癌Tca8113细胞外部形态的影响。
3、片仔癀单独或与多西他赛联合应用48小时后,用Hoechst33258染色后荧光显微镜观察对舌鳞癌Tca8113细胞核形态的改变。
4、流式细胞仪PI单染实验检测片仔癀单独或与多西他赛联合应用后,对舌鳞癌Tca8113细胞周期分布的影响。
5、片仔癀单独或与多西他赛联合应用48小时后,流式细胞仪AnnexinV/PI双染实验检测舌鳞癌Tca8113的凋亡比例。
6、Western blot实验检测应用片仔癀单独或与多西他赛联合应用后,对p-STAT3、Bcl-2、p53蛋白表达的影响。
结果:
1、MTT法实验结果显示片仔癀对舌鳞癌Tca8113细胞增殖有明显的抑制作用,且具有时间依赖性和剂量依赖性。各剂量组之间、各时间组之间两两比较差异均有统计学意义(P<0.01);片仔癀与多西他赛联合应用后,联合应用组的抑制率明显上升,且与片仔癀组、多西他赛组两两比较,差异有统计学意义(P<0.01)。
2、应用倒置显微镜观察发现,对舌鳞癌Tca8113细胞单独应用片仔癀或多西他赛后,细胞形态皆发生明显的变化,凋亡及坏死细胞明显增多,两药联合应用后效果更为显著。
3、Hoechst33258染色后荧光显微镜观察发现,单独应用片仔癀或多西他赛后,见Tca8113细胞细胞核形态发生变化,部分细胞的细胞核内能见到浓染致密的颗粒;当两药联合应用时,以上细胞核形态变化更为明显,且可观察到细胞核呈现环状荧光、核固缩等现象。
4、流式细胞仪AnnexinV/PI双染实验检测结果显示,联合用药组与对照组及各单药组相比,细胞凋亡比例明显升高。经检验,各用药组与对照组之间、联合用药组与各单药组之间两两比较,差异有统计学意义(P<0.01)。
5、流式细胞仪PI单染法结果表明片仔癀使舌鳞癌Tca8113细胞于G0/G1期发生阻滞,同时伴有S期细胞减少,并具有剂量依赖性;多西他赛则使其阻滞于G2/M期,也伴随着S期细胞的减少;两者联合应用,同时阻滞细胞于G0/G1期和G2/M期,且S期细胞的减少比例明显降低。经检验,各用药组与对照组之间、各剂量组之间以及联合用药组与各单药组之间的差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
6、Western Blot结果显示片仔癀抑制STAT3的活化,上调抑癌基因p53的表达并抑制Bcl-2的蛋白表达,且具有剂量依赖性;两药联合应用后,相比于各单独用药组,p-STAT3、Bcl-2蛋白表达明显下调,同时抑癌基因p53蛋白的表达显著上调。
结论:
片仔癀对舌鳞癌Tca8113细胞的增殖起到抑制作用,能诱导细胞凋亡;当片仔癀与多西他赛联合应用后,可协同地发挥对舌鳞癌Tca8113细胞的增殖抑制、凋亡诱导作用,两药的协同抗癌机制可能是通过抑制STAT3的激活,减少Bcl-2的表达以及上调抗癌基因p53的表达。