局灶节段性肾小球硬化（Focal segmental glomerulosclerosis，FSGS）是常见的肾小球疾病，其发病率呈现增加趋势。FSGS由肾脏病理形态学特征来命名，具有发病机制的复杂性和我们认识的有限性。FSGS临床上突出表现为大量蛋白尿和足细胞损伤，而肾小管间质损伤也是其突出的特点。既往的观点认为大量蛋白尿对肾小管的损伤、肾小球节段硬化尤其是血管极硬化性病变至出球小动脉狭窄导致相应肾单位缺血性损伤、肾小球节段病变和包曼囊粘连使尿液返渗至肾间质是FSGS肾小管间质损伤的原因。然而这些机制不足以完全解释临床上观察到的现象，因此阐明FSGS导致肾小管间质损伤的机制对于揭示FSGS的发生发展和临床上寻找治疗干预措施具有重要意义。除了可溶性因子，细胞来源的微囊泡（Microvesicles， MV）是一种新的细胞间信息传递介质，引起人们广泛的关注。体内多种细胞均可释放微囊泡，包括肾小球足细胞、肾小管上皮细胞、尿道上皮细胞等。微囊泡可以借助自身表面携带的粘附分子、受体特异性结合靶细胞或将内容物mRNAs、microRNAs、蛋白及信号分子转移给受体细胞，介导细胞间的信息传递。研究表明胚胎干细胞（ESCs）释放的微囊泡通过mRNA和蛋白的传递重新编程造血祖细胞；人间充质干细胞（MSCs）分泌的微囊泡可以刺激肾小管上皮细胞的体外增殖和抗凋亡作用；内皮祖细胞（EPCs）分泌的微囊泡通过microRNAs的传递保护缺血再灌注的肾小管上皮细胞损伤。我们推测，足细胞在激活或损伤情况下，可能会分泌微囊泡作用于肾小管上皮细胞，产生损伤作用。本研究借助人足细胞系（HPC）、人近端肾小管上皮细胞系（HK-2），研究受损足细胞分泌的微囊泡对肾小管上皮细胞的作用。第一部分：足细胞分泌微囊泡的鉴定一、目的：提取体外培养人足细胞分泌的微囊泡，然后进行鉴定；人尿液足细胞分泌微囊泡的鉴定。二、方法：1、通过超速离心法分别对体外培养人足细胞的培养上清和人尿液进行微囊泡的分离。2、通过电镜、免疫电镜观察微囊泡的超微结构。Western blot验证微囊泡特异性标志物的表达。三、结果：1、电镜下观察体外培养人足细胞微囊泡呈圆形或椭圆形膜性囊泡结构，腔内为低电子致密物质，平均直径大小在30～100nm之间。Western blot和免疫电镜证实微囊泡特异性标志物CD63的表达。2、电镜下观察人尿液微囊泡平均直径大小在40～150nm，有完整的包膜。Western blot证实足细胞特异性标志物podocalyxin的表达。四、结论：足细胞可以分泌微囊泡。第二部分：足细胞分泌微囊泡对肾小管上皮细胞的作用一、目的：通过观察受损足细胞分泌微囊泡对近端肾小管上皮细胞的β-catenin、E-cadherin、Megalin等基因表达和内吞功能的影响，分析足细胞分泌微囊泡对肾小管上皮细胞的损伤作用。二、方法：1、收集正常和LPS刺激足细胞分泌的微囊泡，经荧光标记物（PKH26）标记后孵育肾小管上皮细胞，荧光显微镜观察是否可以进入到肾小管上皮细胞（HK-2）。2、收集正常和LPS刺激足细胞分泌的微囊泡，使用不同浓度的微囊泡作用于HK-2细胞。实时细胞分析仪监测HK-2细胞活力变化；免疫荧光法分析HK-2的β-catenin和Megalin的表达变化和内吞功能的变化；qRT-PCR和Western blot方法检测β-catenin、E-cadherin等mRNA和蛋白水平变化。三、结果：1、比较损伤刺激足细胞分泌的微囊泡蛋白水平变化：与正常组相比，LPS刺激组足细胞分泌的微囊泡蛋白水平升高，具有统计学差异。2、足细胞分泌的微囊泡经PKH26标记后孵育HK-2，荧光显微镜观察HK-2细胞胞浆内充满大量红色荧光物质。3、实时细胞分析仪观察：与正常HK-2细胞和正常足细胞分泌微囊泡刺激HK-2细胞比较，LPS刺激足细胞分泌的微囊泡能抑制HK-2细胞活力，细胞指数最低。4、与正常足细胞分泌的微囊泡相比，LPS刺激足细胞分泌的微囊泡处理HK-2细胞后，免疫荧光结果显示HK-2细胞β-catenin和Megalin表达下降、内吞功能下降；western blot结果显示HK-2细胞β-catenin、E-cadherin的蛋白水平下降，qRT-PCR结果显示β-catenin、E-cadherin、Megalin的mRNA水平下降。四、结论：正常体外培养和损伤刺激足细胞分泌的微囊泡可以进入肾小管上皮细胞。受损足细胞分泌的微囊泡能够导致肾小管上皮细胞发生损伤。