研究背景及目的急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)主要是由胃酸吸入、感染、创伤、脂肪栓塞等引起,感染是最常见原因。不论何种原因所致急性肺损伤,炎症反应都在其病理改变中起了主要作用。虽然,大量的研究试图阐明急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合症的发病机理,但是,至今仍没发现特别有效的治疗手段。目前,急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的治疗上主要以支持治疗、药物治疗和辅助通气治疗为主,临床上仍然保持着很高的病死率,大约维持在30%～40%,因此迫切需要深入研究其发病机制,寻找更加有效的治疗方法。间充质干细胞(MSC)不仅具有低免疫原性、多向分化潜能、诱导免疫耐受、还具有免疫抑制的作用。由于MSCs具有独特的免疫学特性及良好的可塑性,并且MSCs的利用不涉及伦理争议,因此,到目前为止MSCs已成为细胞治疗和组织工程的最佳候选细胞材料。但是,其治疗机制仍然没有完全清楚。核转录因子KB(NF-κB)是近年研究较多的一个促炎因子,其在炎症发生及调节中起了非常重要的作用。近几年的文献报道,阻断肺上皮细胞的NF-κB信号通路可以减轻内毒素诱导的急性肺损伤大鼠的粒细胞性肺炎症反应和肺水肿程度,是肺炎症疾病的有效治疗方法之一。亲环素A(CyPA)是白细胞趋化因子,其通过与其受体CD147结合激活MAPK及核因子KB(NF-κB)通路从而调节促炎因子的释放。目前未发现间充质干细胞在内毒素诱导急性肺损伤中对NF-κB与CyPA的影响的文献报道。本研究旨在研究间充质干细胞对内毒素诱导急性肺损伤的生物学作用及对NF-κB与CyPA的影响,以期进一步阐明MSCs治疗ALI的机制,为临床发现更有效的治疗方法提供实验线索。目的观察C57BL/6J小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体外培养时,细胞的鉴定、形态及定向诱导分化为成骨细胞的特点。方法1取C57BL/6J小鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外全骨髓贴壁筛选法原代培养并传代。2.取原代的MSCs培养至第7代细胞,倒置相差显微镜下观察其生长形态及特征。3.提取第1、3代细胞,胰酶消化后计数,以2×103个/孔接种于96孔板,每孔加入10μlCell Counting Kit-8(CCK-8)溶液,37℃,饱和湿度为5%CO2,培养箱孵育2h后,用酶联免疫检测仪于450nm波长下检测吸光度值。然后在检测后第1、2、3、4、5、6、7天同一时间作相同检测。用吸光度值绘制细胞增殖曲线。4.第5代生长状态良好的C57小鼠BMSCs制成单细胞悬液,以2×103/ml浓度接种于6孔板,待细胞达60%融合时,分别加入成骨诱导培养液及成脂诱导剂进行体外分化培养。5.第5代生长状态良好的C57小鼠BMSCs制成单细胞悬液,收集约2×106个细胞上机进行流式细胞检测。结果1.原代培养的MSCs在24h后开始贴壁,48h后贴壁的MSCs逐渐伸展为不规则圆形、多角形、梭形、排列不规则。2.成骨诱导后镜下观察钙结节染成橘红色、成脂诱导后脂肪细胞里的脂滴呈红色,其它细胞则不着色。3.MSCs的生长曲线呈S型,其生长周期分别为滞后期,对数期和平台期。4.C57小鼠MSCs分化的流式细胞分析显示：MSCs诱导分化后的细胞表面主要有Sca-1、CD34、CD29和CD44标记分子、缺乏CD117分子。结论1.密度离心结合贴壁法可以成功培养、分离出C57BL/6J小鼠骨髓间充质干细胞。2.1×1011L-1的细胞密度是较为理想的原代全骨髓接种密度,2×108L-1是MSCs较为理想的传代密度。待MSCs生长到第3-4天时,细胞生长融合至80%-90%时,培养皿中的细胞是最佳的传代时间。3MSCs能于体外培养大量扩增和存活,在增殖多代后仍然可以保持良好的细胞活性和扩增能力,并于一定条件下可以诱导分化为成骨细胞。4MSCs诱导分化后的细胞表面主要有Sca-1、CD34、CD29、CD44标记分子、缺乏CD117分子。目的首先观察间充质干细胞对内毒素诱导急性肺损伤大鼠的保护作用,然后观察其对大鼠氧化应激及炎症反应的影响。方法1.90只SD大鼠随机分为5组：A组：正常对照组(n=18)尾静脉注射等量生理盐水；B组：内毒素组(LPS)(n=18)：经尾静脉注射LPS5mg/kg；C组：高剂量干细胞组(BMSCH组)(n=18)：经尾静脉注射LPS5mg/kg+BMSC2×106/ml0.5ml；D组：低剂量干细胞组(BMSCL组)(n=18)：LPS5mg/kg+BMSC1×106/ml0.5ml；干细胞对照组(BMSC组)(n=18)：骨髓间充质干细胞2×106/ml0.5ml。分别于造模后6、24、72小时,处死动物收取标本,每个时间点6只(LPS的24小时组因1只死亡固只处死5只)。2.取右肺上叶用于测定肺湿重/干重,取右肺下叶组织(约0.5cm2)放入多聚甲醛中固定,用于组织形态学观察。取其余肺组织于生理盐水中迅速漂洗干净后,立即放入液氮中冷冻,后转入-70℃冰箱中保存备用,腹主动脉采血立即送血气分析。分别测定肺湿重/干重、肺组织MDA、SOD、MP0、TNF-α和IL-1β。3.统计学分析：采用SPSS13.0软件包处理,计量资料以均数±标准差表示,不同处理组间资料均数比较采用析因设计资料的方差分析。各组间同一时间点之间的比较及组内不同时间点间的比较采用完全随机资料的方差分析(one-way ANOVA法),以P<0.05判断差异有显著性。在进行方差分析前,首先进行Levene方差齐性检验。对方差齐性的资料采用LSD法进行多重比较；对方差不齐的资料采用近似F检验的Welch法进行方差分析,并采用Tambane’s T2法进行多重比较。结果1.病理所见：A、E组肺组织结构清晰,肺泡腔无炎性细胞浸润,肺泡壁薄,间质血管无扩张,支气管粘膜上皮完整。B组肺泡结构受到广泛破坏,肺组织水肿及肺间质明显的增宽,肺泡腔内有浆液性渗出,可见大量红细胞以及中性粒细胞,C组为BMSC高剂量组,大部分肺组织及间质结构较完整,小部分肺泡间隔稍增宽,可见肺间质水肿减轻,有少量红细胞及中性粒细胞浸润。D组为BMSC (?)低剂量组,肺泡结构部分被破坏,肺间质中度的水肿,肺泡腔内有多量渗出的红细胞及炎性细胞浸润。2.W/D：不同处理组间有显著差异(F=57.741,P=0.000),时间因素和分组因素交互效应显著(F=3.129,P=0.004)。B组均明显高于A组；24h和72h两个时间点,C、D组低于B组；Pa02比较：B组明显低于A组,C组三个时间点与B组比较,差异均有统计学意义。3.MDA：不同处理组间有显著差异(F=25.742,P=0.000),时间因素和分组因素无显著交互效应(F=0.690,P=0.699)。三个时间点B组MDA明显高于A组,差异有统计学意义；C、D组明显低于B,差异有统计学意义；A组和E组差异无统计学意义。SOD：不同处理组间有显著差异(F=138.052,P=0.000),时间因素和分组因素无显著交互效应(F=0.910,P=0.513)。三个时间点B组低于A组,差异有统计学意义；C、D组明显高于B,差异有统计学意义；E组和A组差异无统计学意义。MPO：不同处理组间有显著差异(F=52.057,P=0.000),时间因素和分组因素无显著交互效应(F=1.096,P=0.376)。三个时间点B组明显高于A组,差异有统计学意义；C、D组明显低于B,差异有统计学意义；A组和E组差异无统计学意义。TNF-a和IL-1β：IL-1β不同处理组间有显著差异(F=151.807,P=0.000),时间因素和分组因素交互效应显著(F=2.085,P=0.048)。TNF-a不同处理组间有显著差异(F=134.814,P=0.000),时间因素和分组因素无显著交互效应(F=1.394,P=0.213)。TNF-α和IL-1β不同组之间存在显著差异(F=123.507,P<0.001)各组同一时间点的比较：B组较A组显著性升高,P<0.05；C、D组低于B组,差异有统计学意义；E组与A组差异无统计学意义。结论1.间充质干细胞移植对内毒素诱导急性肺损伤大鼠具有肺保护作用。2.间充质干细胞移植可以降低急性肺损伤大鼠的氧化应激反应和炎症因子的表达。3.SD大鼠对小鼠的间充质干细胞移植无明显的排异反应,无明显的毒副作用。目的1.观察NF-κB在内毒素诱导急性肺损伤大鼠肺组织的活性变化及间充质干细胞对NF-κB活性的影响,探索NF-κB在内毒素诱导急性肺损伤的发病机理及间充质干细胞治疗机理中的作用。2.观察CyPA在内毒素诱导急性肺损伤大鼠肺组织表达的变化及间充质干细胞对CyPA表达的影响,探索CyPA在内毒素诱导急性肺损伤的发病机理及间充质干细胞治疗机理中的作用。方法1.间充质干细胞的制备：同第一部分。2.肺组织NF-κB及CyPA的Western blot:a、配制SDS-PSGE电泳胶。b、处理样品：依次取样(上样量为10ug)加入到20ul2×SDS凝胶加样缓冲液中,沸水中煮沸8分钟使蛋白变性,然后10000rpm离心5分钟。c、上样：先将梳子小心的移出,把凝胶固定在电泳装置上,内外槽各加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液,取样品用加样器向孔内加入样品,加样量通常在1020ul,将电泳装置与电源连接,接通电源凝胶上胶电压为60伏,当染料前沿进入分离胶后(跑平即可),把电压提高到120伏。继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约0.5cm,然后关闭电源,从电泳装置上卸下玻璃板,用刮勺撬开玻璃板,在凝胶上部一角处切去一角标注加样顺序。d、免疫印迹(Western Blot):(?)将电泳结束后的胶片放入转印缓冲液中,将转印膜也放入转印缓冲液中浸润,进行转膜,膜在正极,胶在负极,分别用滤纸3张/面压住胶和膜。转移时电压100伏,转移时间1小时,电转移时会产热,固应在转移装置的外面加入冰块进行除热,转移结束后,卸下电泳装置,把硝酸纤维素转移膜放入盛有10%脱脂奶粉或10%BSA的封闭液中,封闭2小时或过夜,封闭完毕后用PBST洗膜5次,每次间隔5分钟,加一抗。反应1小时,洗膜5次每次间隔5分钟。(一抗HPS701：200)(一抗HSV11：200),加辣根过氧化物酶标记二抗,按说明书要求的稀释比例加入,反应1小时。洗膜5次每次间隔5分钟。(二抗1：1000),取ECL荧光底物(Pierce公司,货号：37071)A液和B液1各mL,混匀后,将PVDF膜浸泡其中,室温孵育3-5分钟后,用滤纸将PVDF膜表面液体擦干,并将其置于暗室,取医用X光底片覆盖,曝光1分钟后,依次显影、定影即可。3CyPA的RNA提取和Real-PCR:a、抽提RNA。b、反转录：融解反应所需的试剂,上下轻微颠倒混匀,进行短暂离心后放置冰上待用,然后配制RT反应液(所有反应都在冰上进行操作),混匀反应Mix,短暂离心后37-C孵育30小时,反应结束后,85℃灭活处理5min,对所得到的cDNA用灭菌水稀释5倍后做好标记并-20℃保存反转录产物。c、定量PCR实验：通过引物验证预实验确定选取特异性扩增,无引物二聚体、灵敏度高的引物为下游各基因表达量差异分析的使用引物,将All-in-One qPCRMix在室温下融解,轻柔得上下颠倒混匀并进行短暂离心,同时在使用过程中始终保持避光,制备PCR reaction mix(在冰上操作),PCR reaction mix制备后,迅速将稍混匀,并加入96孔板中。4.统计学分析：采用SPSS13.0软件包处理,计量资料以均数±标准差表示,不同处理组间资料均数比较采用析因设计资料的方差分析。各组间同一时间点之间的比较及组内不同时间点间的比较采用完全随机资料的方差分析(one-way ANOVA法),以P<0.05判断差异有显著性。在进行方差分析前,首先进行Levene方差齐性检验。对方差齐性的资料采用LSD法进行多重比较；对方差不齐的资料采用近似F检验的Welch法进行方差分析,并采用Tambane’s T2法进行多重比较。结果1.本研究通过检测核提取物中NF-κBp65的蛋白表达量来决定NF-κB的活性。不同处理组间有显著差异(F=681.495,P=0.000),时间因素和分组因素交互效应显著(F=8.672,P=0.000)。各组NF-κB方差齐性检验：F=1.769,P=0.150,方差齐性。各组之间多重比较选用LSD法。方差分析(ANOVA)结果：F=185.399P=0.000,组间差异有统计学意义。各组同一时间点的比较：三组NF-κB的核内表达量各个时间点之间均有显著性差异(6小时：F=273.165,P<0.001：24小时：F=179.975,P<0.001；72小时：F=254.031,P<0.001=,以B组最、高C组其次、A组最低,且同一时间点各组之间两两比较也均有显著性差异(P<0.05)。2.肺组织CyPA蛋白表达(Western blot)水平的变化：不同处理组间有显著差异(F=984.853,P=0.000),时间因素和分组因素交互效应显著(F=16.884,P=0.000)。各组CyPA方差齐性检验：F=1.865,P=0.130,方差齐性。各组之间多重比较选用LSD法。方差分析(ANOVA)结果：F=278.073P=0.000,组间差异有统计学意义。各组同一时间点的方差分析：三组CyPA的表达量各个时间点之间均有显著性差异(6小时：F=278.01,P<0.001：24小时：F=436.923,P<0.001；72小时：F=412.712,P<0.001),以B组最、高C组其次、A组最低,且同一时间点各组之间两两比较也均有显著性差异(P<0.05)。3.肺组织CyPA mRNA转录(RT-PCR)水平的变化：不同处理组间有显著差异(F=53.680,P=0.000),时间因素和分组因素无显著交互效应(F=0.015,P=1.000)。各组CyPA方差齐性检验：F=2.199,P=0.046,方差不齐。各组之间多重比较选用Tambane’s T2法。方差分析选用近似F检验的Welch法,方差分析结果：F=11.964P=0.000,组间差异有统计学意义。各组同一时间点的两两比较：三组CyPA转录水平各个时间点之间均有显著性差异(6小时：F=18.445,P<0.001：24小时：F=15.117,P<0.001；72小时：F=20.820,P<0.001),以B组最、高C组其次、A组最低,且同一时间点各组之间两两比较也均有显著性差异(P<0.05)。结论1.亲环素A和NF-κB在尾静脉注射内毒素诱导急性肺损伤大鼠的肺组织中表达升高。2.注射内毒素后立即经尾静脉注射小鼠骨髓间充质干细胞显著降低急性肺损伤大鼠的肺组织中的亲环素A和NF-κB的表达。3.亲环素A和NF-κB在内毒素诱导急性肺损伤的发病中起到重要作用,骨髓间充质干细胞可以通过抑制NF-κB的活性和抑制亲环素A的表达而起到治疗作用。