【摘 要】
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视神经脊髓炎（Neuromyelitis optica,NMO）是一种罕见的体液免疫为主介导的中枢神经系统（Central nerve system,CNS）自身免疫性疾病,主要累及视神经、脊髓和脑室周围器官,主要特征是脊髓和视神经的炎症性病变,严重时可导致失明和瘫痪。其主要病理特征为水通道蛋白-4（Aquaporin 4,AQP4）自身抗体（AQP4-immunoglobulin G,AQP4-
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视神经脊髓炎（Neuromyelitis optica,NMO）是一种罕见的体液免疫为主介导的中枢神经系统（Central nerve system,CNS）自身免疫性疾病,主要累及视神经、脊髓和脑室周围器官,主要特征是脊髓和视神经的炎症性病变,严重时可导致失明和瘫痪。其主要病理特征为水通道蛋白-4（Aquaporin 4,AQP4）自身抗体（AQP4-immunoglobulin G,AQP4-Ig G）结合中枢神经系统内星形胶质细胞上的AQP4后,激活补体级联反应,导致一系列炎症反应,进而造成星形胶质细胞丢失,少突胶质细胞受损,髓鞘脱失以及神经元死亡。目前NMO的临床治疗包括免疫抑制以及血浆置换等,但这些治疗手段伴随着较高的复发率以及严重的后遗症。近年来,虽然伊比利珠单抗（Inebilizumab）、萨特利珠单抗（Satralizumab）和依库珠单抗（Eculizumab）已经在国际上获批应用于NMO的临床治疗,但是,这些单克隆抗体都是作用于NMO疾病的非特异性靶点,它们对于人体正常的免疫功能也会有一定影响。为此,特异性阻断致病性抗体AQP4-Ig G与其靶标抗原AQP4结合的药物亟需被开发。本研究通过分离AQP4阳性NMO患者血液中CD19+和CD138+B细胞后进行单细胞测序,通过构建免疫组库得到全人源抗体的重链、轻链序列,通过体外重组表达、鉴定获得全人源的抗AQP4单克隆抗体,并能在体外诱导补体依赖的细胞毒作用（complement dependent cytotoxicity,CDC）。使用该抗体可构建标准化的NMO动物模型,后续对该抗体的进一步改造,有望获取NMO疾病特异性的治疗抗体,为NMO疾病的靶向特异性治疗提供数据支持。本研究通过CD19、CD138磁珠富集AQP4阳性NMO患者外周血中特定类群的B细胞,结合10×Genomics单细胞转录组及V（D）J测序获得抗体的重链、轻链DNA序列;通过数据分析及比对筛选目标抗体DNA序列;通过基因重组、表达纯化等获取目标抗体蛋白;通过酶联免疫吸附（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）、免疫荧光染色（Immunofluorescence,IF）等方法检测目标抗体与AQP4的结合能力,获得能够与AQP4结合的抗AQP4-mAb;通过Live/Dead法检测抗AQP4-mAb体外诱导CDC的能力。研究结果如下:1.确定了17株目标抗体的重链、轻链序列,分别命名为2H、15H、17H、19H、20H、3065-2L、3065-3L、6012-2H、5692-1H、5692-2H、5717-1H、6833-1H、6833-2H、9550-1H、9550-4K、11687-1H和11765-1H。2.成功构建了上述17株抗体的重组表达质粒,并在体外成功重组表达了分泌性的Ig G抗体,293T表达系统和293F悬浮表达系统中Ig G表达量均在1-10 ug/ml。3.鉴定出了4株能够与AQP4相互作用的抗AQP4-mAb。ELISA检测结果显示,与对照组(OD450=0.05)相比较,其中有部分抗体表现出与CHO-AQP4较强的亲和能力。对其中4株mAb:6833-1H（OD450=0.45）、9550-1H（OD450=0.235）、11687-1H（OD450=0.35）和11765-1H（OD450=0.49）的进一步测试表明它们与CHO-AQP4的结合具有浓度依赖性。免疫荧光染色结果显示:4株mAb能够特异性结合AQP4-CHO细胞,也能够使AQP4-GFP质粒瞬时转染的CHO细胞特异性染色,且其红色荧光与GFP的绿色荧光能共定位。4.明确了4株抗AQP4-mAb能够在体外诱导CDC。将抗AQP4-mAb与人补体共同作用于CHO-AQP4细胞,Live/Dead染色结果显示:与不加补体组相比,抗体-补体共同作用组死细胞明显增多,即4株抗体均能够诱导CHO-APQ4细胞的死亡。其中,11765-1H作用最强,9550-1H作用较弱。本研究从AQP4阳性NMO患者外周血中获得了4株具有CDC活性的全人源抗AQP4-mAbs。
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