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目的砷是确认的人类致癌物,但具体的致癌分子机制尚不明确。迄今为止,无机砷致癌机制研究常将恶性转化细胞作为实验模型。课题组前期研究发现,细胞内主要氧化还原敏感的核转录因子红细胞系2p45相关因子-2（nuclea factor erythroid-2p45-repated factor2,NRF2）,在永生化人皮肤角质形成细胞（Immoral human keratinocytes,HaCaT）恶性转化过程中呈持续高水平状态,通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）以及B淋巴细胞瘤-2 蛋白（B cell leukemia/lymphoma 2,BCL2）-Beclinl（BCL2-homology（BH）-3 domain only protein）信号通路调控自噬,具体表现为细胞恶性转化后期发生自噬缺陷。研究报道自噬缺陷的癌细胞可以通过线粒体特异性清除途径获得生存优势。线粒体特异性清除主要途径即线粒体自噬,然而线粒体自噬主要途径PINK1/Parkin通路在砷致细胞恶性转化过程中是否发挥作用以及如何发挥作用尚不明确。本文以课题组前期建立的NaAsO2诱导的恶性转化HaCaT细胞为研究模型,探讨PTEN诱导激酶1（PTEN induced putative kinase 1,PINK1）依赖的线粒体自噬在HaCaT细胞的恶性转化过程中的变化情况以及NRF2对PINK1依赖的线粒体自噬的调控作用,为深入探究砷诱导细胞恶性转化的可能分子机制提供基础资料。方法1、HaCaT细胞恶性转化模型的建立:在NaAsO2含量为0.0μM和1.0 μM的培养基中培养HaCaT细胞至35代,在不同时期检测细胞倍增时间、细胞迁移率和软琼脂克隆形成率。2、探究HaCaT细胞恶性转化过程中线粒体自噬的动态变化情况:结合课题组前期研究,将NaAsO2长期处理至细胞恶性转化过程中的关键代数细胞（0代、1代、7代、14代、21代、28代、35代）用线粒体自噬染色试剂盒（Mitophagy dye）进行固定染色,利用荧光显微镜观察线粒体自噬溶酶体的荧光强度变化情况,确定线粒体自噬的进程;收集细胞,利用蛋白质免疫印迹法检测线粒体自噬关键蛋白 PINK1 和 Parkin（PARK2 encoded E3 ubiquitin ligase）的表达水平;采用双重免疫荧光标记法,半定量分析线粒体上微管相关蛋白1轻链 3（microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3）的水平变化;利用透射电子显微镜（TEM）,观察分析线粒体形态结构以及线粒体自噬溶酶体形成情况的变化;利用酶标仪和试剂盒检测过氧化氢（H2O2）、超氧化物的动态水平。3、明确PINK1依赖的线粒体自噬在NaAsO2致HaCaT恶性转化过程中的作用:利用线粒体自噬抑制剂环孢素A（Cyclosporine A,CsA）处理恶性转化的HaCaT细胞后,使用线粒体自噬染色试剂对其进行固定染色,观察线粒体自噬溶酶体荧光强度的变化情况;利用TEM,观察分析线粒体自噬溶酶体形成情况的变化;采用蛋白质免疫印迹方法检测PINK1和Parkin表达情况的变化;细胞恶性转化情况的检测指标和方法同上。4、确定NaAsO2诱导恶性转化的HaCaT细胞中调控线粒体自噬的可能机制:采用胞浆胞核分离试剂盒分离得到胞浆蛋白与胞核蛋白,利用蛋白质免疫印迹法分别检测细胞关键代数（0代、1代、7代、14代、21代、28代、35代）总NRF2水平与核NRF2水平;利用NRF2 siRNA转染试剂处理砷致恶性转化的HaCaT细胞（T-HaCaT细胞）后,采用线粒体自噬染色试剂对其进行固定染色,观察线粒体自噬溶酶体荧光强度的变化情况;利用透射电子显微镜,观察分析线粒体自噬溶酶体形成情况的变化;蛋白质免疫印迹法检测PINK1、Parkin和NRF2水平变化;之后利用线粒体自噬激活剂羰基氰化物3-氯苯腙（Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone,CCCP）处理已转染NRF2 siRNA的T-HaCaT细胞,检测线粒体自噬和细胞恶性转化程度的变化情况,方法和指标同前。结果（1）NaAsO2致细胞恶性转化相关指标:利用0.0和1.0 μM NaAsO2长期处理HaCaT细胞,发现细胞恶性转化指标发生相应变化:与传代对照组细胞相比,染砷35代细胞倍增时间显著缩短（P＜0.05）,细胞迁移率显著增加（P＜0.05）,克隆形成率明显增高（P＜0.05）。（2）ROS在NaAsO2致细胞恶性转化过程中的动态变化:利用0.0和1.0μM NaAsO2长期处理HaCaT细胞,发现细胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）即H2O2和超氧化物水平:与传代对照组细胞（0.0μM NaAsO2）相比,H2O2和超氧化物水平在细胞暴露于砷的初级阶段（1、7、14代）显著升高（P＜0.05）。然而,在14代以后,随着细胞暴露于砷的时间延长,H2O2和超氧化物水平下降至正常水平。这说明在细胞恶性转化前期,ROS积累。（3）NaAsO2诱导HaCaT细胞恶性转化过程中线粒体自噬相关指标的动态变化:与传代对照组相比,线粒体的长短轴（Aspect Ratio）之比以及形状系数（Form Factor）明显下降（P＜0.05）,说明线粒体碎片化程度明显增强;利用荧光显微镜观察发现T-HaCaT细胞线粒体自噬溶酶体荧光强度较0代细胞明显升高（P＜0.05）;采用双重免疫荧光标记法,发现T-HaCaT细胞线粒体LC3水平较未染砷组显著增加（P＜0.05）;利用透射电子显微镜观察发现T-HaCaT细胞中线粒体自噬溶酶体的数量明显多于传代对照细胞（P＜0.05）;线粒体自噬关键蛋白PINK1和Parkin水平较传代对照组持续上升（P＜0.05）。以上结果提示PINK1依赖线粒体自噬在HaCaT细胞恶性转化过程中被持续激活。（4）线粒体自噬抑制剂CsA处理T-HaCaT细胞后检测相关指标发现:与溶剂对照组细胞相比,C s A处理组线粒体自噬溶酶体荧光强度显著变弱（P＜0.05）,并且通过透射电子显微镜观察发现线粒体自噬溶酶体数量明显减少（P＜0.05）;PINK1和Parkin蛋白水平显著降低（P＜0.05）;在CsA处理组中观察到细胞迁移率和软琼脂克隆形成率较溶剂对照组显著降低（P＜0.05）,细胞倍增时间明显升高（P＜0.05）。以上结果提示在使用线粒体自噬抑制剂后,T-HaCaT细胞恶性转化程度减弱,提示线粒体自噬促进了 HaCaT细胞恶性转化。（5）NRF2 siRNA处理T-HaCaT细胞后检测相关指标发现:检测0代、1代、7代、14代、21代、28代、35代细胞中总NRF2和核NRF2水平,与传代对照组相比,NRF2的总蛋白水平持续升高（P＜0.05）,NRF2核蛋白水平在1,7,21,28,35代均明显升高（P＜0.05）,说明氧化还原敏感的核转录因子NRF2在细胞恶性转化过程中被持续激活。NRF2 siRNA转染后NRF2蛋白表达明显减弱（P＜0.05）,说明NRF2 siRNA转染沉默了 NRF2表达;转染后线粒体自噬关键蛋白PINK1、Parkin表达显著下降（P＜0.05）,线粒体自噬溶酶体荧光强度明显减弱（P＜0.05）,线粒体自噬溶酶体数量明显变少（P＜0.05）,提示NRF2沉默抑制了线粒体自噬发生;细胞迁移率和软琼脂克隆形成率较传代对照组明显降低（P＜0.05）,细胞倍增时间显著增加（P＜0.05）,说明沉默NRF2后细胞恶性转化程度减弱。之后使用线粒体自噬激活剂CCCP进行联合处理,发现与溶剂对照组相比,NRF2蛋白水平无明显变化,而线粒体自噬关键蛋白PINK1、Parkin的水平却显著上升（P＜0.05）,线粒体自噬溶酶体荧光强度明显增强（P＜0.05）,线粒体自噬溶酶体数量显著增多（P＜0.05）,提示NRF2对PINK1依赖线粒体自噬起调控作用;NRF2 siRNA联合CCCP处理组细胞迁移率和软琼脂克隆率较NRF2 siRNA处理组明显增加（P＜0.05）,细胞倍增时间明显变短（P＜0.05）,说明NRF2 siRNA与CCCP联合处理后细胞的恶转程度增强。以上结果表明在细胞恶性转化过程中,NRF2调控线粒体自噬促进了细胞恶性转化。结论在NaAsO2处理致HaCaT恶性转化过程中,氧化还原敏感的核转录因子NRF2通过激活PINK1依赖的线粒体自噬促进了细胞恶性转化。