细胞周期蛋白(Cyclins)是一类在细胞周期活动中起关键作用的蛋白。目前，Cyclins家族已经鉴定了很多成员，它们的共同特征是都含有保守的周期蛋白框序列（Cyclin Box）。通常，Cyclins与周期蛋白依赖性激酶(Cdks)相互作用，通过影响Cdks的蛋白激酶活性而发挥功能。虽然Cyclins/Cdks蛋白的功能最初在细胞周期活动中鉴定，但是目前研究发现，除调控细胞周期外，Cyclins/Cdks蛋白还可以参与调控很多其他细胞活动。　　Ccnyl1是一个新鉴定的Cyclins蛋白成员，它与同家族中的Ccny蛋白有79％的序列相似性，但其功能尚未有研究。本研究发现Ccnyl1基因特异高表达于小鼠睾丸组织中，而在其它组织中表达较低。由于Ccnyl1与Ccny为同源蛋白，我们也检测了小鼠睾丸组织中Ccny的表达，发现在睾丸中Ccny的表达量远低于Ccnyl1。同时我们还检测了不同发育时期Ccnyl1和Ccny在小鼠睾丸组织中的表达变化，结果显示Ccnyl1从三周龄开始迅速表达，并在性成熟后达到高峰，然后趋于稳定表达;而Ccny的表达相对稳定，变化较小。组织切片免疫染色及流式分选实验结果显示，Ccnyl1主要表达于处于减数分裂的生精细胞、圆形和延长形精子中。以上结果提示Ccnyl1可能在精子生成过程中发挥重要作用。　　为阐明Ccnyl1的功能，我们利用Ccnyl1基因敲除小鼠(Ccnyl1-/-)来进行研究。研究发现Ccnyl1-/-小鼠生长发育正常;成年后，雌性小鼠具有正常生育能力，但是雄性小鼠不育。同时，我们也检测了Ccny-/-小鼠的生育能力，发现Ccny-/-雄性和雌性小鼠均能正常生育。以上结果表明是Ccnyl1，而不是Ccny，在小鼠雄性生殖中发挥重要功能。为进一步研究探索Ccnyl1-/-小鼠雄性不育的原因，我们检测了Ccnyl1-/小鼠雄性生殖器官的形态和重量，血清中睾酮和促卵泡激素的含量，生精小管的形态及结构，生精小管中各类群生殖细胞的数目和所占比例，各类群生殖细胞标志基因的表达水平，以及小鼠附睾头部和尾部的精子数目，但均没有发现明显差异。以上结果均表明Ccnyl1不影响雄性生殖器官的发育、激素分泌以及精子生成和精子数目。　　我们利用Computer-assisted semen analysis(CASA)技术分析小鼠精子活力，结果显示Ccnyl1-/-小鼠精子活力远远低于野生型小鼠。在相差显微镜下观察精子结构，我们发现与野生型小鼠的精子相比，Ccnyl1-/-小鼠的精子形态异常，表现为:精子头在颈部弯曲折向中段，中段和主段连接的区域变细，并发生弯折。在微分干涉差显微镜下观察精子结构，我们发现Ccnyl1-/-小鼠精子的中段与主段连接区域的残滴结构缺失。后续的体外精子获能和体外受精实验结果显示，Ccnyl1-/-小鼠精子获能正常，但是体外受精率严重下降。上述结果提示Ccnyl1通过影响精子形态和精子活力进而导致小鼠不育。　　为进一步分析Ccnyl1-/-小鼠精子结构异常及活力下降的原因，首先，我们用透射电镜观察精子结构，结果显示精子头部结构正常，但部分精子头部折向中段，并被残留的残体包住;精子中段与主段间的Annulus结构正常，但与线粒体脱离接触，间隙变大，导致此区域变细，并发生弯折。由于精子中段线粒体结构以及排列数均正常，线粒体标志蛋白Cytochrome C和Cytochrome c oxidase subunit4的蛋白表达量没有明显差异，表明精子中段和主段间的间隙变大并不是由于线粒体缺失导致。其次，免疫染色发现，Ccnyl1-/-小鼠的部分精子在中段与主段之间有微丝、微管散出，透射电镜结果也证实了这一现象，提示微丝、微管合成或组装可能存在异常，因此我们检测了精子中微丝、微管蛋白的表达。结果显示，Ccnyl1-/-小鼠精子中α-tubulin的蛋白量与野生型小鼠没有差异，但β-actin的蛋白量显著增加。因此，我们检测了细胞骨架合成及组装相关蛋白的表达及活力，发现Ccnyl1-/-小鼠精子细胞骨架的组装及解聚都没有异常。以上结果提示，Ccnyl1-/-小鼠精子中β-actin蛋白量增加是由于头部与颈部的残体残留导致，而Ccnyl1-/-小鼠精子微丝、微管散出可能是由于精子尾部折断导致的结构完整性被破坏而产生。　　Ccnyl1是通过怎样的机制来影响精子的形态及功能呢？首先，我们利用睾丸组织的基因表达芯片来寻找靶基因(accession no.GSE67391)，但Ccnyl1-/-小鼠与对照小鼠之间的表达差异很小，提示Ccnyl1可能并非通过转录调控发挥作用。其次，鉴于Ccnyl1和Ccny是高度同源蛋白，文献报道Ccny可以与Cdk14相互作用而调节经典Wnt信号通路。因此我们检测了经典Wnt信号通路相关蛋白，但均没有发现明显变化，提示Ccnyl1并不参与调节经典Wnt信号通路。通过比对已知的基因缺失或突变小鼠表型，我们发现Ccnyl1-/-小鼠表型与Cdk16-/-小鼠表型类似。因此我们检测了Ccnyl1-/-小鼠睾丸组织中Cdk16的表达，发现Cdk16 mRNA表达水平与对照组小鼠没有差异，但Cdk16蛋白水平显著低于对照小鼠。提示Ccnyl1与Cdk16蛋白之间存在相互作用。免疫荧光共定位结果显示Ccnyl1与Cdk16在睾丸组织中存在共定位，特别是在延长形精子中。体内及体外免疫共沉淀结果也进一步证实Ccnyl1与Cdk16之间存在相互作用。　　Ccnyl1与Cdk16相互作用，并且Ccnyl1缺失导致Cdk16蛋白水平下降，由此我们推测，Ccnyl1可能影响Cdk16蛋白稳定性或Cdk16的翻译。通过蛋白稳定性实验以及抑制蛋白降解实验，我们发现Ccnyl1与Cdk16结合后能显著增强彼此的蛋白稳定性。此外，我们发现在Ccnyl1-/-小鼠的睾丸组织中，Cdk16蛋白的条带位置略低于对照组，碱性磷酸酶处理后，两组之间的差异消失，提示两组小鼠的Cdk16蛋白磷酸化修饰存在差异。通过质谱技术，我们鉴定了Cdk16的磷酸化修饰位点，发现Cdk16蛋白的氮端高度磷酸化。我们共鉴定出了22个磷酸化位点，其中19个可信位点。在这19个可信位点中，有9个位点是从未报道过的新位点，分别是S36、S64、S65、S89、S146、T175、T380、S391和S478。当Ccnyl1与Cdk16共表达时，Cdk16的S36、S146、T175和S480位点磷酸化水平显著增强，而S78磷酸化水平显著降低，说明Ccnyl1结合会影响Cdk16的磷酸化修饰。为验证Cdk16磷酸化修饰对其与Ccnyl1相互作用的影响，我们构建了点突变克隆，并发现Cdk16氮端的磷酸化修饰对Cdk16与Ccnyl1的结合具有重要作用。另外，酶活实验结果显示，Cdk16自身激酶活性很低，但与Ccnyl1结合后酶活显著增强。在新鉴定的Cdk16磷酸化位点中，S146磷酸化对Cdk16与Ccnyl1的结合至关重要。S146A及S146D突变都引起Cdk16自身激酶活性降低，同时阻断Cdk16与Ccnyl1的结合。因此Cdk16的磷酸化修饰不仅影响与Ccnyl1蛋白结合，影响彼此的蛋白稳定性，而且也会影响自身的激酶活性。　　总之，研究首次揭示了Ccnyl1的功能，并阐明Ccnyl1通过与Cdk16相互作用，在精子生成及雄性生殖中发挥至关重要的作用。鉴于Ccnyl1的表达特异性，且并不影响小鼠生长发育及激素水平，Ccnyl1可以作为研发干预雄性生殖药物的理想靶点。此外，越来越多的小鼠模型中的研究不断丰富了我们对雄性不育基因因素的认识，这将对临床诊断、治疗及转化研究提供重要理论依据。