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口蹄疫(FMD)是严重影响畜牧业的世界性烈性传染病,除大洋洲、北美洲之外,世界各地皆有流行。国际兽医局(OIE)和联合国粮农组织(FAO)将口蹄疫列为A类烈性传染病之首。我国也将其列为一类动物传染病之首。口蹄疫在发达国家或地区往往通过捕杀感染动物及同居动物、可疑畜群来控制和消灭本病,而发展中国家多采用注射疫苗的方法控制该病的流行。因此在使用疫苗的情况下,如何区分野毒感染动物和注苗动物是控制和消灭该病的关键,建立有效的鉴别诊断方法是口蹄疫防制技术的重要课题,也是国际兽医局(OIE)判定一个国家或地区有无口蹄疫的依据,因此具有十分重要的意义。目前,许多文献的研究都证明检测FMDV非结构蛋白(NSP)抗体可以区分免疫和感染动物。在单个NS蛋白中多聚蛋白3ABC抗体是检测FMD感染的最可靠单一指示器。不管动物是否接种过疫苗,NS蛋白3ABC抗体的检测(通常与其它NSP中的一种或一种以上的抗体联合)是确定是否感染FMDV的证据。以畜群整体而言,检测3ABC抗体能够监测注射疫苗畜群中的感染情况。常规的间接ELISA方法由于采用大肠杆菌的融合表达蛋白,含有痕量的大肠杆菌蛋白,在临床上常会产生假阳性的结果,本研究制备了3ABC蛋白的单克隆抗体,建立了针对FMDV的非结构蛋白3ABC的单抗捕获ELISA和竞争ELISA方法。经临床试验证明,这两种方法均具有较高的敏感性和特异性,可以用于临床检测。具体研究情况如下:1.口蹄疫3ABC蛋白单克隆抗体的制备以纯化的3ABC蛋白为免疫原,免疫Balb/C小鼠,将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA方法筛选,采用有限稀释法对其进行克隆,经过3次融合共获得3株能稳定分泌抗3ABC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1D1,1E2,2E3。三株单抗的腹水效价分别为211×100,211×100,210×100。所有单抗特异性良好,与载体蛋白无交叉反应。2.单抗捕获ELISA的建立和初步应用以单抗1D1包被酶标板,再加入粗提的3ABC蛋白,通过单抗捕获3ABC蛋白,建立了3ABC单抗捕获ELISA方法。用方阵滴定确定单抗浓度为1∶2000,蛋白最佳浓度是2.1μg/ml,最佳血清稀释倍数为1∶400,通过测定160份FMDV阴性血清,确定了该方法的阳性判定标准。特异性、重复性及临床试验结果表明,该方法特异性强、重复性好。与国外同类试剂盒的比较试验,共检测血清184份,两者均检测为阳性14份,均检测为阴性165份,符合率97.28%;与国内同类试剂盒的比较试验,共检测血清168份,两者均检测为阳性3份,均检测为阴性159份,符合率95.83%。3.竞争ELISA的建立和初步应用以3ABC蛋白为抗原,以酶标单抗1D1为第二抗体,建立了检测FMD非结构蛋白3ABC抗体竞争ELISA方法,对于影响ELISA反应条件的各种因素进行了优化和选择。用方阵滴定确定蛋白包被浓度为2.1μg/ml,酶标单抗的浓度为1∶3200,通过检测160份阴性血清,20份阳性血清,确定血清抑制率大于60判定为阳性。特异性、重复性及临床试验结果表明,该方法特异性强、重复性好。