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手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是由肠道病毒感染引起的一种病毒性疾病,主要病原体为新肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯萨奇A16型(Coxsackie A16,CA16),EV71感染常常引发严重的中枢神经系统疾病并发症,CA16是引起心肌炎和心包炎等疾病的主要病原体。目前尚无有效治疗HFMD的药物,疫苗成为防控HFMD暴发最有效的手段之一,因此,研发安全、有效的HFMD疫苗势在必行。本文采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)克隆EV71(中国安徽阜阳株Genbank----FJ607337)VP1和CA16(中国山东株Genbank----GQ253390)VP1基因,构建重组pFastBac HT A-EV71 VP1、pFastBac HT A-CA16 VP1和pFastBac HT B-Mel-EV71 VP1-CA16 VP1质粒,将各重组质粒转化至感受态细胞(DH10),获得各重组Bacmid DNA转染至昆虫细胞(Sf9),应用杆状病毒昆虫表达系统(Bacterium to Baculovirus,Bac-to-Bac)表达或分泌表达各重组蛋白,采用Ni2+离子亲和层析柱纯化各重组病毒表达产物;依据昆虫细胞偏爱密码子优化EV71 P1和EV71 3CD基因克隆至表达载体pFastBac Dual多角体蛋白启动子pPh和pP10上,构建重组pFastBac Dual EV71 P1-3CD质粒,将重组质粒与Bacmid同源重组,转染至Sf9,在Bac-to-Bac系统中利用病毒编码蛋白酶3CD切割核衣壳病毒结构蛋白P1,组装并用蔗糖密度梯度离心纯化EV71病毒样颗粒(Virus Like Particles,VLPs);经免疫细胞化学法证实各目的蛋白在Sf9中的表达;将制备的重组单价蛋白疫苗,腹腔、滴鼻免疫Balb/c小鼠,检测免疫应答水平,取得如下结果:1.所克隆的各DNA片段均与Genbank中的相应DNA序列一致,重组EV71 VP1、CA16 VP1蛋白在Sf9中均获得表达,得到纯化重组蛋白浓度分别为0.318mg/mL和0.412mg/mL,纯度均>90%。2.重组EV71 VP1和CA16 VP1单价蛋白最佳抗原免疫剂量均为20μg;腹腔注射组中,小鼠血清特异性IgG抗体效价分别为875.43和1588.95,中和抗体效价分别为282.84和250.00,抗体亚型分布均以IgG1和IgG2b为主;CD4+/CD8+比值与对照组差异显著(P<0.05),小鼠T淋巴细胞增殖能力增强,脾细胞IL-4分泌数量>IFN-γ分泌数量(P<0.05);鼻腔和小肠灌洗液sIgA抗体与PBS组差异不显著(p>0.05);重组单价蛋白疫苗均可激发一定水平的体液免疫和细胞免疫,不能诱导粘膜免疫应答,以体液免疫应答为主。3.滴鼻免疫EV71 VP1组和CA16 VP1组血清IgG效价分别为278.54和211.66,鼻腔灌洗液sIgA抗体分别为64.31和54.22,小肠灌洗液sIgA抗体分别为15.98和13.55,脾细胞中sIgA-ASCs数量增多,重组单价蛋白疫苗可诱导体液免疫应答和一定水平的粘膜免疫应答。4.利用Bac-to-Bac系统分泌表达了EV71 VP1-CA16 VP1融合蛋白,得到纯化重组蛋白浓度为0.516mg/mL,纯度>90%。5.经昆虫密码子优化的EV71 P1和EV71 3CD基因,利用Bac-to-Bac系统成功组装了EV71 VLPs,纯化了EV71 VLPs的浓度为0.817mg/mL,纯度>90%。结论:制备了重组EV71 VP1和CA16 VP1单价蛋白疫苗,在它们免疫的小鼠模型中,免疫两次均能够产生较好的体液免疫应答,也能产生一定的细胞免疫和粘膜免疫应答;构建、表达和纯化了重组EV71 VP1-CA16 VP1二价融合蛋白和EV71 VLPs。因此,本实验结果为HFMD疫苗的深入研究奠定了基础。