补体免疫是免疫系统中不可或缺的一部分,它不仅是天然免疫的重要组成部分,而且还能激活获得性免疫。补体能快速识别并清除病原微生物,而病原微生物也会进化出不同的机制逃避补体系统的监视,即补体逃逸。猪链球菌是重要的人畜共患病原菌。猪链球菌病的主要临床症状为败血症、肺炎、心内膜炎、关节炎和脑膜炎等,可引起人和猪的死亡。特别是猪链球菌2型强毒株感染,可以逃避补体系统在内的先天性免疫系统的监视,在血液循环系统和全身组织器官中迅速繁殖,引起中毒性休克综合征。但猪链球菌逃逸补体的机制尚不清楚。本实验室前期通过细菌双杂交技术筛选到很多猪链球菌表面蛋白和分泌蛋白可以与补体结合相互作用。本论文的目的是研究猪链球菌的分泌蛋白HylA与补体C3b的互作及其生物学意义。首先我们通过Far-Western Blot和ELISA验证了HylA与C3b的相互作用,并且在蛋白水平证明了HylA可以抑制补体经典途径的激活。接着构建了hylA基因缺失菌株ΔhylA及其互补菌株CΔhylA,并对缺失菌株ΔhylA的抗杀伤、抗吞噬以及致病性等方面进行了深入的研究,主要研究结果如下:1.HylA抑制补体经典途径的激活本实验室前期使用细菌双杂交技术筛选出猪链球菌2型分泌蛋白HylA能与补体C3b相互作用。本研究通过原核表达载体表达纯化了His-HylA蛋白,运用ELISA和Far-Western Blot再次验证了HylA与补体C3b之间的相互作用。为了了解HylA与C3b互作后对补体免疫的影响,我们进行了C3b沉积实验、补体激活实验以及补体介导的红细胞溶血实验,实验结果显示,与亲本菌株SC-19和互补菌株CΔhylA相比较,C3b在缺失菌株ΔhylA表面沉积更多,且差异性显著。补体激活实验中,HylA可以直接激活补体经典途径来消耗补体,从而实现补体逃逸。在补体介导的红细胞溶血实验中,HylA抑制了经典途径介导红细胞溶血,从而再一次证明HylA与C3b互作是影响补体经典途径的激活。2.基因缺失菌株ΔhylA的致病性减弱为了研究hylA基因缺失对猪链球菌致病性的影响,首先本研究进行了与猪链球菌毒力相关的一些实验。在生长曲线和活菌计数实验中,缺失菌株ΔhylA生长明显慢于亲本菌株SC-19和互补菌株CΔhylA,而生长较慢的更容易被免疫系统识别和清除。革兰氏染色和扫描电镜结果显示缺失菌株ΔhylA链长明显长于亲本菌株SC-19和互补菌株CΔhylA,而相关报道称链长的细菌不但生长缓慢而且更容易被吞噬和杀伤。在生物被膜形成实验中,亲本菌株SC-19形成生物被膜的速度比ΔhylA缺失菌株的要快,生物被膜不仅可以逃避免疫系统的监视,还具有抗吞噬功能。上述实验结果表明,缺失菌株ΔhylA比亲本菌株SC-19和互补菌株CΔhylA的毒力弱。为了进一步证明缺失菌株ΔhylA的致病性减弱,本研究进行了ΔhylA缺失菌株的抗吞噬和抗杀伤实验,结果显示缺失菌株ΔhylA的抗吞噬和抗杀伤能力明显低于亲本菌株SC-19和互补菌株CΔhylA。最后本研究进行了小鼠存活率实验,结果显示缺失菌株ΔhylA实验组小鼠的存活率明显高于亲本菌株SC-19实验组小鼠。综上,缺失菌株ΔhylA的毒力减弱,其致病性也明显降低。猪链球菌2型分泌蛋白HylA可以抑制补体经典途径的激活,进而影响补体免疫,猪链球菌由此实现了补体逃逸。