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四溴双酚A(TBBPA)是产量最高的溴系阻燃剂之一,约占整个溴系阻燃剂市场的60%,由于其持久性、生物蓄积性以及对环境和人类健康的潜在不利影响而备受关注。TBBPA作为添加剂已被广泛用于电路板、塑料、建筑材料和纺织品等中,具有防止或减缓火势蔓延的作用。TBBPA常见的衍生物有四溴双酚A-双(2-羟乙基醚)(TBBPA-BHEE)、四溴双酚A-双(缩水甘油醚)(TBBPA-BGE)、四溴双酚A-双(烯丙基醚)(TBBPA-BAE)和四溴双酚A-双(二溴丙基醚)(TBBPA-BDBPE),通常用于工程聚合物或其他TBBPA聚合物的前体。目前,TBBPA及其衍生物已在空气、灰尘、水、土壤、沉积物、生物体及食品等多基质中被广泛检出。这与其暴露方式的多样化与广泛性密切相关,如:食入污染的食物、家庭和汽车粉尘吸入和皮肤接触。基于充分的动物致癌性实验证据和人类机理性证据,国际癌症研究机构(IARC)已将该阻燃剂列为2A级(可能对人类致癌)。然而,TBBPA在不同类型的人类癌症中的致癌潜力和潜在机制了解甚少。肝脏是人体代谢和有毒物质排出的重要器官。而环境污染物暴露,能引起肝脏功能异常并诱发肝脏病变。肝细胞癌(HCC)是全球范围内高死亡率的癌症之一,其发病因素与生活方式和环境密切相关,转移是其不良预后和治疗瓶颈的重要因素。因此,针对TBBPA及其衍生物暴露对肝癌恶化表型影响及分子机制的研究,主要内容如下:(1)癌细胞迁移和侵袭能力的提高,是癌症恶化的重要标志。通过Wound healing的实验确定TBBPA及衍生物对肝癌细胞迁移的影响。实验结果显示,TBBPA与TBBPA-BDBPE呈浓度依赖促进肝癌细胞迁移,且最适浓度为1.00E-8M。在垂直方向上,进一步通过Transwell实验得到了相同的结果。结果表明TBBPA及其衍生物的暴露与肝癌细胞的迁移密切相关。细胞侵袭能力的测定,采用Transwell定向侵袭测定的方法。通过对转移至小室膜下细胞的计数进而评估细胞侵袭能力,结果表明TBBPA在1.00E-8 M的浓度下显著诱导肝癌细胞侵袭。(2)溶酶体胞吐作用在细胞外基质(ECM)降解、细胞迁移、侵袭中起关键作用,与癌症恶化密切相关。然而,癌症恶化过程中亚细胞器层面的分子机制尚不明确。因此,本研究基于溶酶体胞吐作用探究TBBPA诱导肝癌细胞迁移和侵袭的分子机制,并建立基于溶酶体进行肿瘤效应评估的细胞模型。主要内容如下:1)通过Lyso-Tracker Red溶酶体染色分析了溶酶体的数量和分布。实验结果显示,TBBPA暴露处理48h后,细胞中溶酶体的数量以剂量依赖的方式增加,且观察到它们在细胞膜周围聚集分布。通过Flou-3-AM钙离子染色检测细胞中钙离子含量,结果显示TBBPA暴露处理48h后,细胞中Ca2+的数量以剂量依赖方式增加。溶酶体和Ca2+的变化结果,预示TBBPA的暴露与溶酶体胞吐作用密切相关。2)通过immunoblotting方法检测细胞内氨基己糖苷酶-β(HEXB)、组织蛋白酶-B(CTSB)和组织蛋白酶-D(CTSD)及细胞外CTSB、CTSD的表达情况。实验结果显示,TBBPA暴露后,细胞内HEXB、CTSB和CTSD蛋白水平随剂量依赖性降低,而细胞外CTSB、CTSD随剂量依赖性增加,进一步确定了 TBBPA暴露诱导肝癌细胞的溶酶体胞吐作用增强。3)通过MTT实验筛选非致死剂量溶酶体胞吐抑制剂(Vacuolin-1)。Wound healing实验结果表明,Vacuolin-1(0.5μM)处理后细胞迁移能力显著降低,而与TBBPA复合暴露后迁移结果发生逆转,证明溶酶体胞吐作用与细胞迁移能力密切相关。(3)使用AutoDock Vina软件进行分子对接模拟(每个腔60次)。结果表明,瞬时受体电位黏蛋白-1(TRPML1)的激动剂ML-SA1对接模拟得分最高,而TBBPA和衍生物分子中TBBPA得分最高。分子对接模拟结果预示TBBPA及其衍生物可能通过结合TRPML1调节溶酶体胞吐作用进而诱导细胞迁移。接下来,通过基因干扰实验确定靶标蛋白TRPML1。实验结果显示,TRPML1 siRNA转染的HepG2细胞迁移能力下降,且胞内CTSB、CTSD蛋白含量增加,胞外CTSB、CTSD蛋白含量降低,结果表明TRPML1是溶酶体胞吐作用的关键蛋白。以上研究结果表明,TBBPA通过Ca2+介导的TBBPA-TRPML1复合物调节溶酶体胞吐作用,从而促进肝癌细胞的侵袭和迁移。本研究可为TBBPA促进肝癌细胞侵袭和迁移的分子机制提供重要依据,并引起TBBPA暴露对人类健康风险的深切关注。