目的：建立啮齿类动物感觉-运动和学习-记忆神经行为测试组合。应用所建立的学习-记忆行为测试组合研究邻苯二甲酸二异丁酯(DiBP)亚慢性经口染毒对小鼠学习记忆能力的影响,并初步探索其可能的毒性机理。为评价邻苯二甲酸类化合物作为增塑剂用于包装材料的风险提供科学依据。方法：1神经行为毒理学测试组合建立1.1感觉-运动行为测试组合1.1.1试验设计C57BL/6雄性小鼠适应性饲养7d后,以热板试验小鼠添后足的潜伏时间随机分组,设一个对照组和4个丙烯酰胺剂量组,每组15只。染毒剂量分别为5mg/kg bw、10mg/kg bw、20mg/kg bw、30mg/kg bw,每周5次,连续8周,对照组灌胃给予蒸馏水,普通饲料喂饲,自由饮水。前三周每周对各项神经行为指标测量1次,8周喂养试验结束后再测量1次神经行为指标。1.1.2感觉-运动行为学测试方法选择选择伤害性知觉测试、平衡能力测试、抓力测试、运动神经能力测试、自主活动能力测试作为感觉-运动行为测试组合。以上所有试验测试3次,每次间隔30分钟,取平均值。1.2学习-记忆行为测试组合1.2.1试验设计216只雄性昆明小鼠,实验动物房内适应3天,随机分为6组,每组36只,即空白对照组(玉米油)、4个邻苯二甲酸二异丁酯剂量组(50、250、500、1000mg/kg bw)和阳性对照组(氢溴酸东莨菪碱)。对照组给予玉米油溶剂灌胃,各剂量组给予相应剂量的邻苯二甲酸二异丁酯玉米油溶液灌胃,连续8周,每周称重2次。阳性对照组在行为测试前10分钟腹腔注射氢溴酸东莨菪碱5mg/kgbw。染毒前后,分别对小鼠进行学习记忆相关的行为学检测。1.2.2学习记忆行为学测试方法选择选择旷场试验、Morris水迷宫试验、避暗箱试验和穿梭箱试验,作为学习记忆行为测试组合。2邻苯二甲酸二异丁酯对小鼠学习记忆功能的影响及其信号转导机制研究2.1动物选择和染毒方式120只雄性昆明小鼠,实验动物房内适应3天,随机分为5组,每组24只,即空白对照组(玉米油)、4个邻苯二甲酸二异丁酯剂量组(50、250、500、1000mg/kg bw)。对照组给予玉米油溶剂灌胃,各剂量组给予相应剂量的邻苯二甲酸二异丁酯玉米油溶液灌胃,连续8周,每周称重2次。2.2学习记忆行为学检测DiBP染毒后,分别对小鼠进行学习记忆相关的行为学检测,包括旷场试验、Morris水迷宫试验、避暗箱试验和穿梭箱试验,通过上述实验检测小鼠的自主活动能力、空间参考记忆、被动回避和主动回避能力,观察DiBP对小鼠学习记忆能力的影响及判断造模是否成功。2.3脑组织中DiBP含量的测定行为学实验结束后,各组随即抽取6只小鼠托颈椎处死后取其脑组织用于检测,通过应用液相色谱法测定脑组织中DiBP的含量,观察其是否可通过血脑屏障。2.4小鼠海马神经细胞的形态学检测2.4.1光学显微镜标本制备行为学测试结束后,每组随机选取6只小鼠,用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,开胸经左心室插管,先快速灌注预冷的生理盐水直至流出液变清亮、继以4%的多聚甲醛在30分钟内持续灌注,充分固定后,在冰上快速分离海马,取出的海马在4%甲醛中继续固定2h,然后脱水透明后进行石蜡包埋和切片。2.4.2 HE染色光镜观察将切片进行HE染色后,光镜下观察海马组织的形态结构。2.4.3 Nissl小体计数每只小鼠取3张切片,进行Nissl染色。光镜下对海马CA1、CA2和DG区Nissl染色阳性的细胞进行计数,每张切片取连续的3个视野,3张切片的平均值为该样本的阳性细胞数。2.4.4透射电子显微镜观察小鼠灌注预冷的生理盐水及4%的多聚甲醛后,在冰上快速分离海马,切取1mm×1mm×1 mm海马CA3区组织块进行超薄切片,并在透射电子显微镜下观察,照相。2.5神经毡内突触计数在电镜下每个标本随机选取10处神经毡,统一放大至15000倍拍片,计数突触数量并作统计学分析。2.6细胞凋亡率检测制备海马神经细胞悬液,按照凯基Annexin V-FITC & PI凋亡检测试剂盒说明书操作进行流式细胞仪检测。2.7小鼠抗氧化酶活性及DNA损伤测定行为学实验结束后,拔眼球取血分离淋巴细胞,进行彗星实验；取肝脏组织,测定肝脏组织超氧化岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性及丙二醛(MDA)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量；取脑组织测定组织超氧化岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量。2.8小鼠脑组织中氨基酸类神经递质测定采用液-质联用检测法测定。2.9海马组织中cAMP含量测定制备组织匀浆后,采用酶联免疫法测定2.10突触可塑性相关蛋白：NMDAR1蛋白、PSD95蛋白、磷酸化蛋白激酶A(P-PKA)、磷酸化环磷腺苷反应元件结合蛋白(P-CREB)、磷酸化钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(P-CamkⅡ)、脑源性神经营养因子受体(TrkB)蛋白的测定应用蛋白印迹法(Western blot)和免疫组化法测定。2.11海马CREB、BDNF、CaMKⅡ、c-fos和c-jun等相关基因的测定应用Real Time PCR法检测结果：1神经行为毒理学测试组合建立1.1感觉-运动行为测试组合建立1.1.1在整个试验过程中,给予丙烯酰胺的各剂量组无一只动物死亡,各剂量组小鼠的体重与对照组相比无明显变化。通过临床观察未发现各剂量组动物出现躁动、激惹、甚至步态摇摆不稳等临床症状。1.1.2染毒前各组小鼠各项行为学检测结果无明显差异,表明各组小鼠的感觉-运动能力在染毒前处于同一水平。丙烯酰胺染毒结束后,小鼠伤害性知觉、平衡能力、抓力、后肢支撑力均出现了一定的损伤,与以往研究结果相似。1.2学习记忆行为测试组合建立1.2.1在整个试验过程中无动物死亡,各组小鼠体重在喂养期间及喂养结束时与对照组相比无明显变化。1.2.2染毒前各组小鼠行为学检测无明显差异,各组小鼠的学习记忆能力在染毒前处于同一水平。1.2.3阳性物(氢溴酸东莨菪碱)和DiBP均可使昆明小鼠空间参考记忆、被动回避和主动回避能力减退,但对小鼠的自主活动能力影响不明显。2邻苯二甲酸二异丁酯对小鼠学习记忆功能的影响及其信号转导机制研究2.1在整个试验过程中,给予DiBP的各剂量组动物无死亡,各剂量组小鼠的体重在喂养期间及喂养结束时与对照组相比无明显变化。2.2空白对照组、50mg/kg bw和250mg/kg bw剂量组的小鼠脑组织中均未检测到DiBP。500mg/kg bw和1000mg/kg bw剂量组小鼠脑组织中均存在一定水平的DiBP,且1000mg/kg bw剂量组的DiBP含量要显著高于500mg/kg bw剂量组。2.3DiBP可使昆明小鼠空间参考记忆、被动回避和主动回避能力减退,但对小鼠的活动能力影响不明显。2.4HE染色结果显示,250mg/kg组3例、500mg/kg组3例、1000mg/kg组2例组织可见海马锥体细胞层数减少,排列稀疏、不规则,细胞体积变小,核固缩现象明显。Nissl染色结果显示,空白对照组椎体细胞排列整齐、密集,尼氏体含量丰富。1000mg/kg bw剂量组细胞排列松散,小鼠海马CA1、CA3和DG区域单位面积的细胞数量较空白对照组少,并且有统计学差异(P<0.05)。其它各剂量组细胞排列较为整齐,细胞层数无明显减少,尼氏体清晰,各区域尼氏小体数量与空白对照组相比无统计学差异。透射电镜下观察可见,对照组小鼠海马CA3区神经元胞浆和胞核染色质分布均匀,细胞核形态规则,核膜光滑,细胞器丰富。但各剂量组小鼠海马CA3区神经元的超微结构发生了不同程度的病理改变,且以500mg/kgbw和1000mg/kg bw剂量组最甚。2.5随着染毒剂量的增高,各剂量组小鼠海马CA3区神经毡内突触数量逐渐减少,且500mg/kg bw和1000mg/kg bw剂量组突触数量与空白对照组相比减少明显,有统计学差异(P<0.01)。2.6随着DiBP染毒剂量增高小鼠海马神经细胞凋亡率有升高的趋势,1000mg/kgbw剂量组和空白对照组相比有统计学差异(P<0.05)。2.7小鼠抗氧化酶活性及DNA损伤研究结果显示,各剂量组小鼠肝脏组织中的SOD和GSH-PX活性降低,MDA和8-OHdG含量增加。250mg/kg和1000mg/kg剂量组脑组织中GSH-PX活性降低,各剂量组脑组织中8-OHdG含量增加。对照组小鼠淋巴细胞DNA基本呈圆形,无拖尾出现,各染毒剂量组小鼠淋巴细胞DNA则出现不同程度拖尾现象。2.8DiBP对兴奋性氨基酸(GLU、ASP)无影响,而抑制性氨基酸(GABA)含量,随着DiBP染毒剂量的增加有下降趋势,且1000mg/kg bw剂量组与对照组相比有显著性差异。2.9随着DiBP染毒剂量的增加小鼠海马组织cAMP含量有降低的趋势,1000mg/kg bw剂量组与对照组相比差异也具有统计学意义(P<0.05)。2.10各DiBP剂量组小鼠海马PSD95、NMD AR1、p-CAMKⅡ、p-PKAC和p-CREB蛋白表达水平与对照组相比均有所下调,并且随着剂量的增加这种改变越明显。2.11DiBP可通过cAMP/PKA-CREB信号通路下调CREB、BDNF、CaMKⅡ、c-fos和c-jun等基因的表达。结论：1.感觉-运动行为试验组合(热板试验、转棒试验、抓力试验、后肢支撑力试验、自主活动能力试验)和学习-记忆行为试验组合(旷场试验、Morris水迷宫试验、避暗箱试验和穿梭箱试验)可针对化学毒物的感觉-运动毒性和学习-记忆毒性进行筛查,提供敏感的毒性识别指标。2.首次利用学习-记忆行为毒性研究,证实DiBP可使小鼠学习记忆能力受损。首次证实DiBP经口摄入后可通过血脑屏障进入脑组织,并使海马组织发生形态学改变。3.首次发现亚慢性暴露DiBP可导致小鼠海马cAMP-PKA信号通路中主要信号分子发生异常改变,使CREB磷酸化水平下降,CREB下游基因的表达水平下降,这可能是DiBP致学习记忆功能损伤的重要分子机制。4.研究证实DiBP可使小鼠抗氧化防御系统功能降低,并导致DNA损伤。