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背景神经管畸形（neural tube defects,NTDs）,是在胚胎早期发育阶段因生物、理化等多种因素影响,导致神经管闭合失败而产生的一系列先天性的中枢神经系统缺陷疾病。目前,NTDs的发生机制仍不明了。在众多不确定的因素中,及时补充适量的叶酸是可能降低NTDs发生风险因素中较为明确的。研究认为,仅局限于弥补叶酸含量不足并不能完全规避NTDs的出现,因此,叶酸代谢障碍而不仅仅是叶酸不足的探索方向被提出,当叶酸代谢通路中的关键酶被抑制时,NTDs可以被独立诱导发生,这一点在课题组前期已被证明。氟化N,N-二烷基氨基二苯乙烯-5（Fluorinated N,N-dialkylaminostilbenes,FIDAS-5）,是甲硫氨酸腺苷转移酶（methionine adenosyltransferase,MAT）的抑制剂,继而影响叶酸循环中的甲硫氨酸（methionine,Met）代谢。FIDAS-5可以干扰机体的甲基供体——S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylhomocysteine,SAM）的生成,理论上可以进一步地影响到不仅限于核酸和蛋白质等参与的一系列生物化学反应。当抑制MAT引起甲硫氨酸代谢出现障碍时,是否干扰神经管发育以及如果出现了神经管闭合异常,其分子机制又是怎样的,目前都有待于探索。因此,本研究旨在通过利用MAT的抑制剂FIDAS-5干扰甲硫氨酸循环,建立NTDs动物模型并初步探索其发生机制,为从不同维度继续探索神经管畸形的发生奠定基础。目的1.利用MAT抑制剂FIDAS-5,制备NTDs动物模型。2.观察FIDAS-5对小鼠胚胎神经上皮细胞增殖和凋亡的影响。3.初步探索Wnt/PCP-JNK通路在FIDAS-5致NTDs发生中的作用及机制研究。方法1.利用FIDAS-5构建NTDs动物模型,检测相关代谢物水平将C57BL/6小鼠随机进行分组并合笼,在小鼠妊娠7.5天（E7.5）时,对照组腹腔注射含1%DMSO的生理盐水,实验组分别注射不同剂量的FIDAS-5溶液,妊娠11.5天（E11.5）时在体视显微镜下剥离胚胎并观察胚胎发育情况。记录胚胎总数及畸形胚胎个数,测量胚胎顶臀长和体重。对小鼠胚胎脑组织切片,HE染色,观察神经管发育情况。ELISA方法检测小鼠胚胎脑组织中SAM、SAH水平。2.检测注射FIDAS-5后胚胎脑组织切片中神经上皮细胞增殖和凋亡的变化免疫组化检测胚胎组织切片中神经上皮细胞增殖改变;TUNEL方法观察神经上皮细胞的凋亡变化;Western blot定量检测小鼠胚胎脑组织中增殖蛋白PCNA和凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3的表达。3.检测Wnt/PCP-JNK通路在FIDAS-5诱导NTDs中的影响应用免疫组化、免疫荧光分别检测小鼠胚胎脑组织的DVL1、RhoA的含量;采用Western blot检测通路相关蛋白DVL1、RhoA、JNK、p-JNK的表达。CCK-8检测HT-22细胞增殖;AO-EB染色法和流式细胞术用于观察HT-22细胞的凋亡水平变化;Western blot检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）和凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3的表达量。结果1.建立了FIDAS-5诱导的小鼠NTDs模型,给药剂量为20mg/kg时,发生NTDs的概率最高为34.8%。出现NTDs表征的小鼠的主要表现以后脑畸形为主,也出现了小眼畸形和发育迟缓的其它畸形类型。NTDs组的胚胎体重和顶臀长明显低于对照组的。ELISA检测到NTDs胚胎脑组织中的SAM和SAH的含量水平以及SAM/SAH比值与对照组的相比都低。2.对胚胎脑组织进行切片染色的结果显示,NTDs组胚胎神经管闭合失败,管腔壁厚薄不均匀,腔体走向不规则,顶板处仅靠羊膜和间质包裹,细胞排列紊乱不规则;对照组胚胎的脑组织发育良好,神经管闭合完整,管腔对称,神经上皮细胞排列紧密。3.免疫组化结果表明,NTDs胚胎脑组织中PCNA表达明显比对照组少（P＜0.05）。Western blot结果也显示PCNA在NTDs胚胎脑组织中表达量较少（P＜0.01）;TUNEL法检测凋亡结果的显示NTDs组胚胎脑组织中凋亡细胞明显增加（P＜0.01）。Western blot法检测胚胎脑组织中凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3,结果显示NTDs胚胎脑组织的凋亡水平较高（P＜0.01）。4.采用免疫组化、免疫荧光方法对Wnt/PCP-JNK通路中的DVL1和RhoA检测,发现两者阳性细胞数在实验组里均显著增加（P＜0.01）;Western blot测量信号通路蛋白表达量,结果显示NTDs组胚胎中的DVL1、RhoA、JNK以及p-JNK表达水平均明显升高。5.CCK-8结果表明,HT-22细胞在FIDAS-5浓度为4umol/L时存活率减半。AO-EB染色实验和流式细胞术用于检测细胞凋亡水平,两个结果均表明实验组的HT-22凋亡水平较高。Western blot定量检测结果表明,实验组的HT-22细胞中PCNA的表达量减低（P＜0.05）,Cleaved Caspase-3的表达较高（P＜0.01）。结论1.应用MAT抑制剂FIDAS-5成功建立了NTDs小鼠模型。2.FIDAS-5可以引起细胞的增殖和凋亡失衡。3.Wnt/PCP-JNK通路介导了FIDAS-5诱导NTDs的发生。