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目的:明确脂肪来源外泌体对神经干细胞增殖分化能力的影响,探讨皮下脂肪组织移植对神经发生的作用。方法:1.选取6-8周雄性SD大鼠,运用低速离心法收集血浆及脂肪组织上清,通过超高速离心法提取皮下脂肪组织来源外泌体(subcutaneous adipose tissue derived exosomes,SAT-exo)、内脏脂肪组织来源外泌体(visceral adipose tissue derived exosomes,VAT-exo)和血浆来源外泌体(plasma derived exosomes,Plasma-exo)。分别采用马尔文粒度仪、透射电子显微镜和Western Blotting技术检测外泌体的粒径大小、形态特征和蛋白标志物的表达。2.将外泌体与PKH26染料进行孵育,获得PKH26标记的外泌体。分离培养新生(Postnatal day 0,P0)小鼠海马(hippocampus,Hip)的神经干细胞(neural stem cells,NSCs),将NSCs与PKH26标记的外泌体共同孵育12h,检测NSCs是否摄取外泌体。3.采用BCA法检测提取的外泌体蛋白浓度后存于-80℃备用。然后分离培养P0NSCs,分别运用1×PBS(Ctrl组)、每10万细胞2μg蛋白量外泌体(2μg-exo组)或每10万细胞7μg蛋白量外泌体(7μg-exo组)处理NSCs 24h,掺入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)检测外泌体对NSCs增殖能力的影响。10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)诱导NSCs分化,分别用1×PBS、2μg-exo或7μg-exo处理NSCs 3~5天,进行Tuj1免疫荧光染色检测外泌体对NSCs分化为神经元的影响。4.收集野生型(Wild type,WT)小鼠的皮下脂肪组织进行脂肪移植,将其移植到1月龄Seipin全身性敲除小鼠(Seipin-s KO小鼠)及其对照小鼠的背部皮下。实验分为野生假手术组(WT-sham),seipin敲除小鼠假手术组(KO-sham),野生移植组(WT-AT)和seipin敲除小鼠移植组(KO-AT)四组,移植4月后运用Ki67和DCX免疫荧光染色检测海马齿状回颗粒细胞下层(Subgranular zone,SGZ)神经发生情况。5.脂肪移植之后,运用Y迷宫自发交替实验检测各组小鼠工作记忆能力,运用高架O迷宫实验检测各组小鼠的焦虑行为。结果:1.马尔文粒度仪检测结果显示Plasma-exo的平均粒径为130.3nm,SAT-exo的平均粒径为123.5nm,VAT-exo的平均粒径为93.88nm。透射电子显微镜检测结果显示外泌体呈现向内凹陷的杯状或盘状结构。Western Blotting检测Plasma-exo、SAT-exo、VAT-exo均表达外泌体标志物肿瘤易感基因101蛋白(TSG101),四次跨膜蛋白家族(CD63、CD81),以上实验说明提取的细胞外囊泡为外泌体。2.在激光共聚焦显微镜下发现PKH26标记的外泌体进入NSCs的胞质中,并主要聚集在NSCs核周围,表示NSCs可以摄取外泌体。3.运用Brd U掺入实验检测Plasma-exo,SAT-exo,VAT-exo对NSCs增殖能力的影响。分离培养NSCs,Brd U免疫荧光染色结果显示,Plasma-exo组中,7μg-exo和2μg-exo的Brd U阳性率均较Ctrl组显著增高(P<0.01);SAT-exo组中,7μg-exo和2μg-exo的Brd U阳性率均较Ctrl组显著增高(P<0.01);VAT-exo组中,与Ctrl组相比,7μg-exo和2μg-exo的Brd U阳性率无明显变化(P>0.05)。4.运用Tuj1免疫荧光染色检测Plasma-exo,SAT-exo,VAT-exo对NSCs分化能力的影响。Tuj1免疫荧光染色结果显示,Plasma-exo组中,7μg-exo和2μg-exo的Tuj1阳性率均较Ctrl组明显增高(P<0.05);SAT-exo组中,7μg-exo和2μg-exo的Tuj1阳性率均较Ctrl组明显增高(P<0.05);VAT-exo组中,7μg-exo和2μg-exo的Tuj1阳性率无明显变化(P>0.05)。5.脂肪组织移植后,肉眼观察到KO-AT组小鼠移植的脂肪组织生长良好。Ki67免疫荧光染色检测脂肪移植对小鼠SGZ细胞增殖能力的影响,与WT-sham组小鼠Ki67阳性细胞数564.5±32.21相比,KO-sham组的小鼠Ki67阳性细胞数286.6±37.45明显降低(P<0.01),脂肪移植后KO-AT组小鼠Ki67阳性细胞数为455.1±38.14,较KO-sham组小鼠显著增加(P<0.01)。运用DCX免疫荧光染色检测脂肪移植对小鼠NSCs向神经元方向分化能力的影响,结果显示与WT-sham组小鼠DCX阳性细胞数966.0±67.03相比,KO-sham组小鼠DCX阳性细胞数578.8±48.80显著下降(P<0.01),脂肪移植后,KO-AT组小鼠的DCX阳性细胞数为831.4±79.46,较KO-sham组小鼠明显增高(P<0.01)。6.脂肪移植后Y迷宫自发交替实验结果显示,四组小鼠的进臂总次数无明显差异。检测四组小鼠的入臂正确率,结果显示KO-sham小鼠的入臂正确率为59.09%±5.88%,较WT-sham小鼠77.68%±6.19%显著降低(P<0.01),KO-AT组小鼠的入臂正确率为77.40%±6.37%较KO-sham小鼠明显上升(P<0.01)。高架O迷宫实验检测小鼠在开放臂停留的时间来反应小鼠的焦虑情绪。结果显示与WT-sham小鼠开放臂停留时间21.6s±7.24s相比,KO-sham组小鼠6.83s±2.76s显著降低(P<0.01)。KO-AT组小鼠开放臂停留的时间达23.33s±10.54s较KO-sham小鼠明显增高(P<0.01)。结论:(1)皮下脂肪组织来源的外泌体促进海马神经干细胞的增殖和分化(2)移植皮下脂肪组织能改善全身性seipin基因缺失小鼠海马齿状回颗粒细胞下层的神经发生。