随着规模化养殖技术的不断进步和发展、交通运输的快捷等因素,增加了猪群之间的接触机会,也为病原体的流行和传播创造了机会,造成发病猪群呈现两种或多种病原的混合感染的现状。越来越多的研究表明PCV2和CSFV在猪体内能够发生共感染,并且临床的研究表明PCV2能干扰CSFV弱毒疫苗的保护效力,给养猪业带来重大的经济损失。然而,PCV2-CSFV共感染时相互作用和对宿主的影响机制还未知。在本研究中,为获得效价较高的CSFV C株的多克隆抗体,利用PEG6000浓缩法和蔗糖密度梯度离心纯化法,制备纯化的CSFV样品。结果表明,经浓缩纯化的CSFV仍具有较高的感染活性,且毒价为病毒原液的101.5倍以上。将纯化的CSFV作为抗原接种新西兰大白兔,获得特异性和效价均较高的抗CSFV兔多抗血清。为了有效地研究PCV2和CSFV共感染过程中病毒的交互影响以及细胞参与病毒复制的潜在机制,建立了一个的体外共感染模型。在该模型下PCV2不受CSFV复制影响,CSFV对PCV2没有免疫排斥现象;而CSFV的增殖却以PCV2剂量依赖性的方式降低。PCV2和CSFV能定位于同一个细胞,且CSFV的E2从正常的细胞质定位,易位到细胞核中。此外,相同剂量的PCV2感染PK15和PK15-CSFV,PCV2的感染率相同,并且介导的细胞凋亡程度无显著性差异;然而,PCV2剂量与细胞凋亡呈现正相关,表明PCV2介导的凋亡可能与CSFV复制下调有关。另外,灭活PCV2及PCV2病毒成分孵育细胞不能介导细胞凋亡或影响CSFV复制,表明PCV2复制介导的凋亡影响CSFV复制。这些结果足以解释临床上PCV2和CSFV共同感染导致更严重的临床症状,以及CSFV弱毒疫苗免疫失败问题。为了探究在PCV2和CSFV共感染过程中涉及的宿主因子和分子机制,使用iTRAQ标记结合LC-MS/MS质谱鉴定技术,分析阴性(NE)、PCV2单独感染(SP)、CSFV单独感染(SC)和PCV2-CSFV共感染(PC)的PK15样品的整体蛋白质组表达情况。在3次重复实验中,共有3932个蛋白均检测到。以表达比例≥ 1.2或≤0.83且p 5 0.05作为上下调的阈值,与NE相比,SP中上、下调蛋白数分别为304个和198个,SC中分别为60个和61个,PC中分别为196个和156个。相对定量PCR、蛋白免疫印迹和共聚焦激光扫描显微镜技术验证的结果表明,大部分基因/蛋白的表达趋势与iTRAQ蛋白质组结果一致。聚类、GO和KEGG分析证明在PCV2和CSFV共感染过程中PCV2具有主导作用。对PC/SC差异表达蛋白进行IPA分析,结果显示蛋白14-3-3ζ、cullin3、ERK1/2、caspase和NF-κB可能在PCV2影响CSFV在体外完成生命周期的过程中具有重要作用。另外,进一步对共感染条件下特异性差异表达的184个蛋白进行KEGG和IPA分析,结果表明线粒体呼吸链复合物I、IV和V的多个蛋白均下调表达,由此推断线粒体可能是PCV2和CSFV共感染时的主要靶标;除了线粒体功能失常外,共感染还特异性影响了氧化磷酸化、Nrf2介导的氧化应激、tRNA装载、Myc介导的凋亡信号传导和细胞内多种代谢通路的信号通路。这些数据为研究PCV2和CSFV共感染过程对细胞通路的影响及其分子机制提供参考。综上,本研究获得了高效价高纯度的CSFV C株病毒以及抗CSFV的兔多抗,为检测CSFV提供工具;建立了 PCV2和CSFV共感染模型,确定共感染过程中PCV2介导的细胞凋亡是削弱CSFV复制的原因;通过基于iTRAQ的蛋白质组学和生物信息学分析,证明了 PCV2和CSFV共感染过程中PCV2的主导作用,并且确定了共感染过程中重要的蛋白分子及其所涉及的信号通路。然而,这些蛋白和信号通路在共感染过程中的确切功能,还需要进一步研究。