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研究背景Th17细胞分泌的细胞因子IL-17介导了非嗜酸性粒细胞性哮喘（NEA）的中性粒细胞浸润为主的气道炎症。IL-6诱导STAT3磷酸化,是调控na?ve T细胞分化为Th17细胞的关键;SOCS3是Th17细胞分化过程中重要的负反馈调节蛋白。我们前期研究结果表明血红素加氧酶-1（HO-1）可以抑制Th17细胞分化,进而减轻Th17细胞介导的中性粒细胞性气道炎症,但是HO-1抑制Th17细胞分化的分子机制尚不清楚。研究目的通过建立NEA模型,观察HO-1干预对NEA气道炎症、Th17细胞分化及其信号通路的影响。在此基础上,经体外实验阐释HO-1调控Th17细胞分化的具体机制,为HO-1抑制Th17细胞分化进而减轻NEA气道炎症提供理论基础和治疗靶点。研究方法1、雌性DO11.10小鼠连续3天经鼻滴入OVA,建立NEA模型。采用Hemin和Sn PP腹腔注射干预HO-1表达,计数BALF细胞总数、Gr-1+细胞比例;ELISA检测肺组织匀浆（LH）和BALF中IL-17A、IL-6、IL-10水平;观察气道炎症改变。2、OVA滴鼻制备NEA模型过程中,每次滴鼻24 h后取肺脏或脾脏Western blot检测HO-1、RORγt、SOCS1、SOCS3表达,ELISA检测LH和BALF中IL-17A、IL-10的水平。3、免疫磁珠分选（MACS）NEA模型小鼠的脾脏na?ve T细胞,体外OVA323-339刺激培养,Western blot检测Th17细胞分化信号通路中相关蛋白表达。4、分选BALB/c小鼠脾脏na?ve T细胞,加入Hemin或Sn PP培养,观察HO-1在培养后24 h,48 h,72 h,96 h的表达;na?ve T细胞在Th17细胞分化条件下培养5天,FCM检测CD4+IL-17A+细胞（Th17细胞）比例,Western blot检测STAT3、p-STAT3、SOCS3蛋白的表达,ELISA检测不同时间点上清液中IL-17A含量。5、BALB/c小鼠连续2天腹腔注射Hemin诱导HO-1表达后:（1）MACS脾脏na?ve T细胞,Th17细胞分化条件下培养,于1 h,4 h,24 h,5d收集细胞,Western blot检测信号蛋白表达;（2）提取脾脏细胞,FCM检测CD4+IL-6R+细胞和CD4+IL-23R+细胞比例;（3）分选na?ve T细胞,加入IL-6刺激,Western blot检测不同时间点STAT3、p-STAT3、HO-1蛋白表达。6、利用蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）方法,Western blot检测HO-1和信号蛋白间相互作用;通过HO-1质粒和STAT3结构域质粒共转染293T细胞,行Co-IP及Western blot检测HO-1和STAT3结构域相互作用的位点。7、转染HO-1 si RNA及腹腔注射Hemin干预HO-1表达建立NEA模型,免疫荧光观察肺组织FAM si RNA表达情况,FCM检测BALF中Gr-1+细胞比例,H&E和PAS染色观察肺组织病理学改变。Western blot检测肺组织和na?ve T细胞Th17细胞分化相关信号蛋白表达;ELISA检测na?ve T细胞培养上清IL-17A、IL-10水平。8、经尾静脉注射转染HO-1 si RNA,随后连续2天腹腔注射Hemin,分选脾脏na?ve T细胞,在Th17细胞分化条件下培养5天,Western blot检测观察HO-1干预对Th17细胞分化信号蛋白的表达。研究结果1、与Con组比较,NEA组BALF细胞总数和Gr-1+细胞比例显著增加,肺IL-17A、IL-6和IL-10增高,肺组织中见大量炎性细胞浸润;NEA+Hemin组上调HO-1表达后,BALF细胞总数和Gr-1+细胞比例均下降,肺IL-17A和IL-6降低,显著抑制气道炎症,并促进IL-10高表达。而NEA+Sn PP组逆转NEA+Hemin组的改变。2、NEA模型制备过程中,随着OVA激发次数的增加:（1）各组肺组织IL-17A表达逐步增高,IL-10在OVA激发时表达亦增加,随后逐步降低;而上调HO-1表达则抑制IL-17A产生幅度,并维持IL-10高水平。（2）在OVA激发组,肺组织RORγt、SOCS3和HO-1表达逐步增高;Hemin诱导HO-1高表达后则抑制RORγt和SOCS3表达,而Sn PP逆转这一改变。（3）在NEA模型中,HO-1干预前后对肺组织SOCS1表达无影响。3、在NEA模型中,HO-1通过抑制na?ve T细胞STAT3磷酸化,从而下调Th17细胞分化的核转录因子RORγt表达,SOCS3表达同样受抑制;但JAK2活化未改变。4、Hemin诱导HO-1的表达在4872小时最高,Sn PP不能促进HO-1表达。Na?ve T细胞在Th17细胞分化条件下培养5天,显示HO-1能降低Th17细胞比例和IL-17A水平,其对IL-17A的抑制作用在培养72 h最明显;且HO-1能抑制STAT3磷酸化和SOCS3表达。5、动态分析HO-1对Th17细胞分化的调控作用,发现HO-1在STAT3磷酸化启动后,才发挥其调控作用,抑制RORγt和SOCS3表达;同时证实,HO-1是通过调控IL-6-STAT3信号通路进而对下游相关信号分子产生抑制作用。6、内源性HO-1作用靶点是STAT3,与JAK1、JAK2和SOCS3无相互作用。进一步显示HO-1作用于STAT3结构域的N-末端、DNA结合域、连接域、SH2结构域、转录激活域,与螺旋域无作用。7、HO-1 si RNA可以逆转HO-1在NEA模型中的保护作用,BALF中Gr-1+细胞比例增高,H&E和PAS染色显示肺组织炎症较明显加重,同时促进STAT3-RORγt信号通路的活化。8、体外Th17细胞分化条件下,进一步证实HO-1 si RNA能逆转HO-1对STAT3的抑制作用,进而促进RORγt表达。但JAK1和JAK2活化未改变。结论1、体内NEA模型中,HO-1抑制Th17反应,促进IL-10表达,进而抑制Th17细胞介导的中性粒细胞性气道炎症;干扰HO-1的表达,可以逆转HO-1对中性粒细胞性气道炎症的抗炎作用和对Th17细胞信号通路的抑制。2、HO-1通过阻断IL-6-STAT3-RORγt/SOCS3信号通路,抑制下游核转录因子RORγt和负反馈调节蛋白SOCS3表达,降低Th17细胞分化,进而抑制Th17细胞介导的中性粒细胞性气道炎症。而SOCS1未参与该炎症反应。3、HO-1对Th17细胞分化的调控,是通过HO-1和STAT3结合,进而抑制STAT3的磷酸化,提示STAT3是HO-1调控Th17细胞分化的靶蛋白。