腹泻是一种世界流行性疾病，在卫生条件比较落后的地区发病率较高，而且具有明显的季节性。在我国，感染性腹泻的发病率居所有传染病之首。我们的监测结果显示，腹泻病原菌中致腹泻大肠埃希菌所占的比例呈上升的趋势。临床上对致腹泻病原菌的检测主要应用常规微生物分离及生化鉴定，费时费力，缺乏试剂，标准不一，很难适应快速检测与鉴定的需要。虽然分子生物学技术已经应用到传染病病原的检测，但操作复杂、试剂不齐全且不稳定，限制了分子生物学技术在临床上推广。就致腹泻大肠埃希菌而言，还没有比较成熟的、能同时鉴别不同型别菌株的分子生物学方法。本研究旨在建立一种同时检测五种致腹泻大肠埃希菌的多重PCR方法，探索影响多重PCR扩增的因素；探讨模拟粪便标本的前处理方法，将建立的多重PCR方法应用于检测临床分离菌株以及模拟粪便标本，对多重PCR方法进行评价，使多重PCR方法能够直接从临床标本中检测与鉴别相应的致腹泻大肠埃希菌。本研究应用DNAStar软件，针对五种致腹泻大肠埃希菌EAEC、EHEC、EIEC、EPEC、ETEC的毒力相关基因设计并验证相应的引物，建立了检测五种致腹泻大肠埃希菌的单重PCR方法。单重PCR能够快速、敏感、特异地鉴别出五种致腹泻大肠埃希菌，每个反应中能检测到的最低菌量不一，敏感性也从51 CFU／反应到1.31×10~5 CFU／反应不等。在单重PCR方法的基础上，通过调整影响多重PCR扩增的主要因素，系统探索和优化反应条件，使一步PCR能够同时鉴定五种大肠埃希菌，获得比较好的扩增结果，建立了能够同时检测的多重PCR方法。其敏感性比相应的单重PCR略低。通过对不同菌株进行扩增，验证了此方法的特异性，与单重PCR比较并鉴定了16株致腹泻大肠埃希菌分离株，15株的检测结果相互吻合，只有一株EIEC菌株用多重PCR扩增为阴性，与单重PCR符合率为93.8％。以EAEC标准菌株为代表株，制备含有EAEC单一菌株的模拟粪便标本，选择不同的处理方法，对模拟粪便标本进行前期处理，以获得细菌DNA。用单重PCR对提取的相应模拟粪便标本的模板进行扩增，评价并确定模拟粪便标本前处理方法。通过比较七种模拟粪便标本的前处理方法，最终筛选出适用于PCR扩增的处理模拟粪便标本方法。其中，集菌煮沸后纯化法、集菌后提取基因组法、直接煮沸后纯化法、试剂盒法制备的模板均可以用于单重PCR扩增，前两种方法在模拟标本离心后，沉淀与上清的界限不够明显，易形成粪便悬浊液，实验结果与实验人员操作密切相关；试剂盒方法根据操作手册提取，重复性好，但需要耗费的时间较长，操作过程复杂，成本较高；直接煮沸后纯化的方法操作简便、快速、重复性好。综合分析，用单重PCR方法进行扩增时，直接煮沸后纯化法是标本处理的首选方法。实验室制备含有五种致腹泻大肠埃希菌的模拟标本，分别用直接煮沸后纯化法和试剂盒法提取模拟标本中的总核酸，多重PCR方法扩增结果表明，试剂盒方法明显优于直接煮沸后纯化核酸的方法，是进行多重PCR前处理模拟粪便标本的首选方法。将模拟标本接种LB培养基，增菌4～6h后用煮沸法制取模板，每个反应中能检测到的模板量相当于接种时2CFU。本研究建立了一种稳定、敏感、特异、快速的多重PCR反应方法，该方法能同时检测五种致腹泻大肠埃希菌，比常规的细菌学诊断快速、简便和实用。应用建立的多重PCR法，检测模拟粪便标本，能够对标本中的致腹泻大肠埃希菌直接分型鉴定。